郭麗萍 張國(guó)淳 陳博 王鈺雷 廖寧南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州5055）；廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）乳腺科（廣州50080）

乳腺癌是當(dāng)今世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是女性罹患癌癥死亡的最主要原因之一。據(jù)最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年全美預(yù)估新發(fā)乳腺癌近268 600例，同時(shí)預(yù)估高達(dá)41 760例女性死于乳腺癌［1］。盡管目前全球乳腺癌高發(fā)地區(qū)集中在北美和西歐地區(qū)，但近年來(lái)亞洲地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且與北美等地區(qū)的發(fā)病率差距正在逐步縮?。?］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)女性乳腺癌新診斷病例約30.4萬(wàn)，居女性癌癥發(fā)病的第1位，由此可見(jiàn)，乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性健康的罪魁禍?zhǔn)祝?-4］。研究［5-7］表明，長(zhǎng)期暴露于高水平的內(nèi)源性或外源性雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine 5′-diphospho-glucuronosyltransferase 1-1，UGT1A1）作為體內(nèi)Ⅱ相生物反應(yīng)酶的重要成員之一，其參與雌激素的葡萄糖磷酸化，促使雌激素及其代謝產(chǎn)物從體內(nèi)清除［8］。研究表明，UGT1A1基因多態(tài)性，尤其是UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性可影響人體內(nèi)UGT1A1酶的含量及活性，影響雌激素在體內(nèi)的代謝過(guò)程，進(jìn)而可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［9］。目前，關(guān)于UGT1A1基因多態(tài)性在乳腺癌中的研究結(jié)果不一，對(duì)其在乳腺癌中的作用機(jī)制尚無(wú)定論。因此，本研究采用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)中國(guó)乳腺癌人群中UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性的分布情況，并對(duì)二者與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，擬初步探索其在乳腺癌的可能作用，以為臨床個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究納入2017年2月1日至2018年6月30日就診于廣東省人民醫(yī)院乳腺科的乳腺癌患者251例，中位年齡48歲（25～85歲），所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性乳腺癌，均為漢族女性，且無(wú)乳腺癌或其他腫瘤家族史。收集所有患者的臨床病例資料，包括年齡、月經(jīng)狀態(tài)、原發(fā)腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期（參照第8版AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)［10］）、病理學(xué)分級(jí)、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、激素受體狀態(tài)（hormone receptor，HR）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth receptor-2，HER2）狀態(tài)等。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的ER、PR、HER2狀態(tài)及Ki-67指數(shù)進(jìn)行分子分型分類：Luminal A型（ER陽(yáng)性，PR陽(yáng)性，HER2陰性，Ki-67≤14），Luminal B 型（HER2陰性）（ER 和/或PR陽(yáng)性，HER2陰性，Ki-67＞14），HER2陽(yáng)性型（HR陰性）（ER陰性且PR陰性，HER2陽(yáng)性），HER2陽(yáng)性型（HR陽(yáng)性）（ER陽(yáng)性，PR陽(yáng)性或陰性，HER2陽(yáng)性），三陰型（ER陰性且PR陰性，HER2陰性）?；颊叩呐R床病理資料見(jiàn)表1。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑高速臺(tái)式離心機(jī)（HERMLE Z230MR，德國(guó)）、聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀（Bio-Rad T100，美國(guó)）、DNA提取試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）、Nextseq500測(cè)序平臺(tái)（Illumina公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取取乳腺癌患者外周血10 mL，以EDTA抗凝處理，嚴(yán)格按照外周血DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取純化基因組DNA，-20℃下保存?zhèn)溆?。NGS文庫(kù)構(gòu)建至少需要50 ng cfDNA。

1.3.2 NGS測(cè)序本研究采用目標(biāo)基因捕獲測(cè)序技術(shù)。將上述提取的DNA進(jìn)行末端修飾，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，并采用特定的探針捕獲特定的DNA片段，基因檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域捕獲范圍包括UGT1A1*28、UGT1A1*6位點(diǎn)及其鄰近的100 bp區(qū)域。富集的DNA庫(kù)在Nextseq500測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增并行高通量測(cè)序，測(cè)序深度為10 000X，將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并生物信息學(xué)分析，得出UGT1A1基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切檢驗(yàn)分析UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，以Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)檢測(cè)UGT1A1*28、UGT1A1*6二者的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性在中國(guó)乳腺癌人群中的分布情況在251例乳腺癌患者中，UGT1A1*28野生型（*1/*1）、雜合突變型（*1/*28）、純合突變型（*28/*28）的分布頻率分別為80.9%（203/252）、19.1%（48/251）、0%（0/251）；UGT1A1*6野生型（G/G）、雜合突變型（G/A）、純合突變型（A/A）的分布頻率分別為72.1%（181/252）、25.5%（64/251）、2.4%（6/251）。

2.2 UGT1A1*28多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性UGT1A1*28多態(tài)性與乳腺癌患者激素受體狀態(tài)密切相關(guān)。在ER陽(yáng)性乳腺癌患者中，UGT1A1*28等位基因所占比例明顯高于ER陰性患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（21.9%vs.9.1%，P=0.032）。PR陽(yáng)性組亦高于PR陰性組（23.2%vs.7.6%，P=0.005）。UGT1A1*28多態(tài)性與發(fā)病年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HER2狀態(tài)均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。UGT1A1*28多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性見(jiàn)表1。

2.3 UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌患者ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)、分子分型、發(fā)病年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性見(jiàn)表1。

2.4 UGT1A1*28、UGT1A1*6二者的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性二者中國(guó)乳腺癌患者中的分布不具有相關(guān)性（r=-0.031，P=0.621）。

3 討論

UGT1A1基因位于人類2q37染色體，是UGTs家族中的一員，其編碼的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1是生物體進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化最重要的代謝酶之一，可促進(jìn)膽紅素、脂溶性維生素、雌激素、伊立替康等內(nèi)源性化合物和外源性藥物的葡萄糖磷酸化，通過(guò)增加底物極性，使其更容易從體內(nèi)代謝清除［11-14］。除此之外，UGT1A1還參與多種致癌物的代謝［15］。UGT1A1基因多態(tài)性可影響UGT1A1的表達(dá)，導(dǎo)致人體內(nèi)UGT1A1酶的含量及活性降低。UGT1A1酶表達(dá)于乳腺組織，并參與雌激素的失活，UGT1A1的低表達(dá)可能導(dǎo)致體內(nèi)雌激素水平的增加，使細(xì)胞暴露于更高的雌激素濃度，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相應(yīng)的影響。

表1 UGT1A1*28、UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between UGT1A1*28、UGT1A1*6 polymorphism with clinicopathological features in breast cancer例（%）

UGT1A1基因以插入、缺失、單核苷酸多態(tài)性等形式在個(gè)體間表現(xiàn)出很大的差異。目前研究最多的區(qū)域?yàn)閱?dòng)子區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)［16-17］。UGT1A1野生型（UGT1A1*1）為啟動(dòng)子區(qū)含6個(gè)TA重復(fù)序列，而突變型（UGT1A1*28）則表現(xiàn)為含有7個(gè)TA重復(fù)序列。在乳腺細(xì)胞中UGT1A1轉(zhuǎn)錄活性的功能顯示該基因的轉(zhuǎn)錄激活與TA重復(fù)序列的數(shù)量成反比。與UGT1A1*1相比，UGT1A1*28等位基因表現(xiàn)出65%活性。UGT1A1*6為第一個(gè)外顯子rs234669144位點(diǎn)G突變?yōu)锳，并且與野生型相比，突變型活性下降約70%［8］。本研究結(jié)果顯示：在中國(guó)乳腺癌患者中，UGT1A1基因型以野生型UGT1A1*1/*1為主，占80.9%，其次為雜合突變型，所占比例為19.1%。ADEGOKE等［18］報(bào)道，中國(guó)乳腺癌人群UGT1A1*1/*1、UGT1A1*1/*28、UGT1A1*28/*28的分布頻率分別為：77.1%、20.8%、2.1%。UGT1A1*1/*1、UGT1A1*1/*28基因型所占比例與本研究結(jié)果相近，而本研究尚未檢出純合突變型UGT1A1*28/*28患者，存在差異的原因可能與樣本量、檢測(cè)方法等有關(guān)。既往研究表明，在希臘乳腺癌人群中，UGT1A1*1/*1、UGT1A1*1/*28、UGT1A1*28/*28的分布頻率分別為34.4%、51.0%、14.6%［19］；非洲乳腺癌人群UGT1A1*1/*1、UGT1A1*1/*28、UGT1A1*28/*28的分布頻率分別為：29.5%、49.0%、21.5%［20］。綜合以上結(jié)果顯示，中國(guó)乳腺癌人群中UGT1A1*28多態(tài)性以野生型UGT1A1*1/*1為主，而希臘及非洲乳腺癌患者以雜合突變型UGT1A1*1/*28為主，且希臘及非洲乳腺癌患者中純合突變型UGT1A1*28/*28所占的比例明顯高于中國(guó)患者。UGT1A1*6多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道，UGT1A1*6多態(tài)性目前僅發(fā)現(xiàn)于亞洲人群中，我國(guó)一項(xiàng)小樣本量研究發(fā)現(xiàn)，UGTlA1*6基因多態(tài)性在中國(guó)乳腺癌人群中分布：67%（n=31）為野生型，26%（n=12）為雜合突變型，7%（n=3）為純合突變型［21-22］。但是該研究?jī)H納入46例乳腺癌人患者，數(shù)據(jù)代表性欠佳。本研究共納入251例乳腺癌患者，為最大樣本量基于二代基因測(cè)序技術(shù)探索中國(guó)乳腺癌人群中UGT1A1*6多態(tài)性分布情況的研究，且本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相近，這更加說(shuō)明中國(guó)乳腺癌人群中約25%患者表現(xiàn)為UGT1A1*6雜合突變型，純合突變型所占比例不足10%。

乳腺癌是一類激素依賴性腫瘤，雌激素是女性罹患乳腺癌的主要危險(xiǎn)因素之一。在正常情況下，雌激素可促進(jìn)乳房組織的生長(zhǎng)和發(fā)育，并維持女性生殖系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。然而，雌激素信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，雌激素過(guò)度刺激靶細(xì)胞增殖，增加了DNA復(fù)制錯(cuò)誤的幾率，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，并誘導(dǎo)惡變［23-24］。作為Ⅱ相反應(yīng)酶，UGT1A1參與雌激素及其代謝產(chǎn)物的葡萄糖醛酸化，UGT1A1基因突變可引起雌激素失活障礙，導(dǎo)致雌激素及其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積，從而增加乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于UGT1A1多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的研究結(jié)果不一。ADEGOKE等［18］發(fā)現(xiàn)，中國(guó)乳腺癌人群與健康人群相比，UGT1A1*28多態(tài)性總體分布率無(wú)明顯差異，進(jìn)行年齡分層發(fā)現(xiàn)，攜帶UGT1A1*28等位基因且年齡＜40歲的女性，乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加（OR=1.7，95%CI：1.0～2.8）。關(guān)于希臘人群的研究［19］結(jié)果表明，UGT1A1*28多態(tài)性與希臘人群乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯關(guān)系（P=0.49）。然而，一項(xiàng)關(guān)于非洲本著女性UGT1A1多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的臨床研究卻顯示出截然不同的結(jié)果，其結(jié)果顯示，在絕經(jīng)前女性中，攜帶UGT1A1*28等位基因是該人群罹患乳腺癌的一個(gè)保護(hù)因素（OR=0.47，95%CI：0.26～0.83）［20］。不同種族的研究得出不一致的研究結(jié)果，原因可能有以下兩點(diǎn)。（1）UGT1A1通過(guò)影響體內(nèi)雌激素水平，可能參與乳腺癌的發(fā)病進(jìn)程，然而，體內(nèi)雌激素的水平受多個(gè)基因的調(diào)控，并且與環(huán)境因素相關(guān)，研究結(jié)論存在差異的原因可能是由于不同遺傳背景及生活方式，UGT1A1基因在不同人群中所起的作用程度可能存在差異。（2）乳腺癌是一類具有很強(qiáng)異質(zhì)性的疾病，在非洲本著乳腺癌人群中激素受體陰性患者更為常見(jiàn)，而在中國(guó)與希臘乳腺癌人群中以激素受體陽(yáng)性患者為主，UGT1A1可能差異地影響具有不同激素受體狀態(tài)的女性的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合本研究結(jié)果顯示，UGT1A1*28與乳腺癌激素受體狀態(tài)密切相關(guān)，超過(guò)95%UGT1A1*28等位基因發(fā)生在激素受體陽(yáng)性型乳腺癌中，其可能通過(guò)影響雌激素的代謝進(jìn)而影響激素受體陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前關(guān)于UGT1A1*6與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系僅有1篇文獻(xiàn)報(bào)道，有學(xué)者［21-22］發(fā)現(xiàn)，UGT1A1*6等位基因在漢族乳腺癌人群中所占的比例顯著高于健康人群，其可能是漢族女性罹患乳腺癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素。關(guān)于UGT1A1*6在乳腺癌中的研究仍處于初步階段，有望更多研究探索其與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

綜上所述，UGT1A1*28等位基因在激素受體陽(yáng)性型乳腺癌中所占比例顯著升高，提示其可能參與激素受體陽(yáng)性型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。但是，本研究為單中心的小樣本研究，實(shí)驗(yàn)方法單一，具有一定局限性，至于UGT1A1*28基因多態(tài)性通過(guò)何種途徑參與激素受體陽(yáng)性型乳腺癌發(fā)生過(guò)程，尚需進(jìn)一步深入研究探索和證實(shí)，以期為臨床個(gè)體化治療提供靶點(diǎn)，為治療帶來(lái)新思路。