朱敏航，李紫薇，陳玄立，袁 瓊，周乾毅，張永忠

(武漢科技大學 醫(yī)學院 新藥創(chuàng)制研究所 職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430065)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種由于糖代謝紊亂引起心臟結構和功能障礙為主要病理改變的心肌病變。隨著生活質(zhì)量的提高，糖尿病的發(fā)病率也逐漸增高，繼發(fā)于糖尿病的心血管并發(fā)癥逐漸成為糖尿病患者死亡的主要原因。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者70%以上死于心血管系統(tǒng)疾病，是非糖尿病患者心血管系統(tǒng)疾病病死率的2～3倍，許多研究證實心肌細胞焦亡可能參與其中[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥和能量代謝異常的發(fā)生關系密切，認為趨化因子和促炎性細胞因子誘導的慢性炎癥過程是糖尿病心肌病心肌損傷的重要發(fā)病機制之一[2-3]。

無患子皂苷(Soapnut Saponin)是從野生落葉喬木無患子(SapindusmukorossiGaertn.)果皮中提取出來的一類皂苷類化合物。其果皮提取物中主要活性成分為三萜皂苷類(Ⅰ)、倍半萜糖苷類(Ⅱ)、蛋白質(zhì)和脂肪油，其中三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，已證實對人體皮膚有抗菌、殺菌、消炎和祛屑止癢功效，除此之外還含有多種有益于人體的物質(zhì)[4]。糖尿病引起的高血糖會促進血小板聚集，又可引起脂質(zhì)過氧化物合成增加。大量研究表明，Ⅱ型糖尿病的氧化應激能耗盡抗氧化防御系統(tǒng)的活性，導致氧自由基增多。同時，脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物為一種很強的具有生物毒性的物質(zhì)[5]。有研究表明大多數(shù)皂苷具有顯著的抗氧化作用，可清除體內(nèi)氧自由基，顯示出抗血小板聚集的活性。采用乳酸脫氫酶泄露分析方法測定無患子皂苷，沒有明顯的細胞毒活性，還表現(xiàn)出比阿司匹林具有更強的抗血小板聚集的活性[6]。

本研究擬探究無患子皂苷對高糖誘導的心肌細胞損傷保護作用機制，為糖尿病性心肌病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 藥材

成熟無患子果實(SapindusmukorossiGaertn′s fruit)：2017年收取于武漢科技大學黃家湖校區(qū)無患子樹，果實由張永忠副教授鑒定并存放于武漢科技大學醫(yī)學院。

1.2 細胞株

H9C2心肌細胞株(上海ATCC細胞庫)，經(jīng)復蘇后，于含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 試劑

齊墩果酸對照品(上海阿拉丁生化科技有限公司)；二甲雙胍(源葉生物技術有限公司，LOT：Y12J7C16020)；caspase-1及β-actin抗體(鼠抗，Santa Cruz Blotechnology)；IL-1β及NLRP3抗體(兔抗，Cell Signaling Technology)；抗鼠及抗兔二抗(武漢科瑞生物技術有限公司)；SP免疫組化檢測試劑盒及DAB工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(力康Heal Force)；超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；酶標儀(Biotek Epoch)；CCD成像系統(tǒng)(Laica Microsystems，型號DM750)；臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，型號 5427R)。

2方法

2.1 無患子皂苷的提取和純化

無患子果皮洗凈、晾干、粉碎，稱取無患子藥材粉末(過三號篩)約2.5 g。精密測定，加6倍量85%乙醇回流提取3次，每次2 h，得無患子皂苷的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇至無醇味，加150 mL蒸餾水溶解，水飽和的醋酸乙酯萃取3次，每次80 mL，棄去醋酸乙酯層，合并水層。再用D101大孔樹脂純化，以3BV/H的速度進行洗脫，收集50%的洗脫液，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。制備標準曲線，經(jīng)過計算，無患子皂苷濃度以齊墩果酸計為12.58 mg/mL。

2.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

H9C2心肌細胞株常規(guī)復蘇后加入DMEM培養(yǎng)基(含糖量15 mmol/L)、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃，5 % CO2)。實驗共分六組：正常對照組、高糖損傷組、低劑量無患子皂苷處理組(3 μmol/L)、中劑量無患子皂苷處理組(10 μmol/L)、高劑量無患子皂苷處理組(30 μmol/L)以及二甲雙胍處理組(50 μmol/L)。正常對照組細胞采用含糖量15 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖損傷組細胞采用含糖量50 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，無患子皂苷處理組和二甲雙胍處理組則在高糖損傷組的基礎上給予不同劑量的無患子皂苷和二甲雙胍進行處理，處理時間均為48 h。

2.3 Western blot實驗

各組處理后的細胞使用RIPA裂解液裂解并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，封閉后孵育相應目的蛋白的抗體：caspase-1及β-actin抗體(鼠抗，1∶2000)、IL-1β及NLRP3抗體(兔抗，1∶2 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次后室溫孵育Ⅱ抗，HRP-抗兔(1∶1 000)、HRP-抗鼠(1∶2 000)1 h，洗膜3次，ECL顯影。

2.4 細胞爬片制作

DMEM培養(yǎng)基(含糖量15 mmol/L)培養(yǎng)的H9C2心肌細胞胰酶消化后按8×104個/孔的密度種于放有多聚賴氨酸包被的無菌圓形蓋玻片的24孔板內(nèi)，置于二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后分組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用4%的多聚甲醛固定備用。

2.5 SP免疫組化實驗

取出細胞爬片后PBS洗兩次，0.5% Triton通透處理15 min，采用SP法嚴格按照說明書操作檢測caspase-1(1∶100)、IL-1β(1∶100)及NLRP3(1∶200)蛋白表達情況，DAB顯色，PBS代替一抗做陰性對照。顯色完畢后，90%甘油封片，在CCD成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像，每組隨機選取5個視野進行平均光密度測量，并計算其均值后進行統(tǒng)計學分析。

2.6 統(tǒng)計學方法

所有實驗均重復3次，所取得的數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics 19.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行處理。采用單因素方差分析進行多組比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 高糖損傷H9C2細胞模型建立

采用免疫組化和Western Blot檢測細胞中caspase-1、IL-1β蛋白表達情況，結果見圖1。免疫組化結果顯示高糖損傷組caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達水平相較于正常對照組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western Blot結果同樣顯示高糖損傷組caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達水平相較于正常對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。結果提示高糖誘導了H9C2心肌細胞的焦亡，高糖損傷細胞焦亡模型建立成功。

3.2 無患子皂苷抑制高糖誘導的H9C2心肌細胞焦亡

采用免疫組化和Western Blot檢測細胞中caspase-1、IL-1β蛋白表達情況，結果見圖1。免疫組化和Western Blot結果均顯示無患子皂苷處理組caspase-1及IL-1β兩種蛋白表達水平相較于高糖損傷組均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，呈劑量依賴現(xiàn)象。與高糖損傷組相比，二甲雙胍處理組caspase-1及IL-1β兩種蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。高劑量無患子皂苷處理組與二甲雙胍處理組效果相當。

(a)免疫組化光鏡圖(DAB顯色，400×)；(b)免疫組化結果統(tǒng)計圖；(c)Western Blot檢測結果及統(tǒng)計圖。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 對照組；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 高糖組；△P< 0.05 VS 低劑量組，▲P< 0.05 VS 中劑量組。

圖1 各實驗組Caspase-1、IL-1β蛋白的表達

3.3 無患子皂苷抑制高糖誘導的H9C2心肌細胞NLRP3表達

采用免疫組化和Western Blot檢測六組細胞中NLRP3蛋白表達水平，結果見圖2。免疫組化及Western Blot結果均顯示高糖組NLRP3蛋白表達水平相較于正常對照組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。同時，實驗結果顯示NLRP3蛋白在無患子皂苷治療組中的表達水平明顯低于高糖組，且三種給藥劑量呈現(xiàn)出不同的降低程度。高劑量無患子皂苷對高糖誘導損傷后的NLRP3表達抑制作用與二甲雙胍治療組相當。

(a)免疫組化光鏡圖(DAB顯色，400×)；(b)免疫組化結果統(tǒng)計圖；(c)Western Blot檢測結果及統(tǒng)計圖。+P< 0.05，++P< 0.01 VS 高糖組；*P< 0.05，**P< 0.01 VS 對照組；△P< 0.05 VS 皂苷低劑量組，▲P< 0.05 VS 皂苷中劑量組。

圖2 實驗各組NLRP3蛋白的表達

4 討論

細胞焦亡是一種程序性細胞死亡，又稱細胞炎性壞死，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)容物的釋放，進而激活強烈的炎癥反應。細胞焦亡在抗擊感染中具有重要作用，是機體一種重要的天然免疫反應。細胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實的一種以依賴于半胱天冬酶-1(caspase-1)，并伴有大量促炎癥因子釋放為特征的新的程序性細胞死亡方式。細胞焦亡的形態(tài)學特征、發(fā)生及調(diào)控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式。細胞焦亡相比于細胞凋亡(apoptosis)發(fā)生得更快，并會伴隨大量促炎癥因子的釋放，因此可以通過檢測細胞內(nèi)炎癥因子的表達水平以及caspase-1蛋白的表達水平來判斷細胞是否發(fā)生了焦亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導的H9C2心肌細胞損傷組中，caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達水平相較于正常對照組均明顯升高，表明細胞產(chǎn)生了焦亡。

炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識別受體(PRRs)參與組裝的一類多蛋白復合物，是天然免疫系統(tǒng)中十分重要的組成部分。炎癥小體具有識別病原相關分子模式(PAMPs)或者宿主來源的危險信號分子(DAMPs)的能力，并能夠招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1?；罨腃aspase-1切割IL-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生相應的成熟細胞因子。炎癥小體的激活還能夠誘發(fā)導致細胞的炎癥壞死(pyroptosis)。目前已經(jīng)有多種炎癥小體被確定參與了針對多種病原體的宿主防御反應，病原體也已經(jīng)進化出多種相應的機制來抑制炎癥小體的活化。在本實驗中，NLRP3蛋白表達水平的改變與caspase-1、IL-1β兩種蛋白表達水平的改變趨勢一致，表明無患子皂苷抑制高糖誘導的H9C2心肌細胞焦亡可能是通過NLRP3信號通路來進行調(diào)控的。

本研究對無患子皂苷的這種保護作用機制的探究也為糖尿病心肌病的治療提供了一個新思路。自古以來，無患子一直是我國民間常用的洗滌用品，尤其常用于潔面和洗發(fā)。本實驗中無患子皂苷治療組細胞中Caspase-1、IL-1β蛋白的表達水平相較于高糖損傷組均有下降，表明無患子皂苷對高糖誘導的心肌細胞焦亡產(chǎn)生了抑制作用。無患子皂苷在糖尿病細胞模型中表現(xiàn)出來的保護作用為糖尿病心肌病的治療提供了一個新的方案。無患子皂苷作為一種天然產(chǎn)物，其毒副作用較小，具有抗真菌、抗細菌多種生物活性，并且在本研究中顯示出了對高糖誘導的H9C2心肌細胞焦亡的抑制作用，可能作為一種新型糖尿病性心肌病的治療藥物，抑制心肌細胞的焦亡，減輕和延緩糖尿病的心血管并發(fā)癥。但是本研究僅對無患子皂苷的藥理活性進行了探究，還未進行藥物代謝動力學、毒理學等體內(nèi)分析，是否可以正式作為臨床治療糖尿病的新藥還有待進一步探究。

綜上所述，高糖能夠誘導H9C2心肌細胞產(chǎn)生焦亡，無患子皂苷對高糖誘導的H9C2心肌細胞損傷具有保護作用，且該作用通過NALP3調(diào)控caspase1、IL-1β等下游基因來實現(xiàn)。