劉 蕾，劉富崗，馮素香，5，6*

(1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450053；2.河南省兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450053；3.鄭州兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450053；4.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州，450046，5.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046；6.河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

瓜子金系遠(yuǎn)志科植物瓜子金的PolygalajaponicaHOUTT.的干燥全草，具有祛痰止咳、活血消腫、解毒止痛的功效，臨床用于治療咳嗽痰多，咽喉腫痛；外治跌打損傷，疔瘡癤腫，蛇蟲(chóng)咬傷[1]。瓜子金所含化學(xué)成分主要有皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、甾醇、脂肪油、揮發(fā)油、四乙酸酯等成分[2-5]。對(duì)其中的酸性多糖類(lèi)成分的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，為了加深對(duì)瓜子金酸性多糖的研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)瓜子金酸性多糖的含量測(cè)定方法進(jìn)行了考察，采用間羥基聯(lián)苯法[6]以D-半乳糖醛酸為對(duì)照品測(cè)定瓜子金酸性多糖的含量，以期為瓜子金酸性多糖的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Satorius-CPA225D十萬(wàn)分之一天平(奧多力斯科學(xué)儀器有限公司)；DZF-300型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鄭州長(zhǎng)城科工有限公司)；D-半乳糖醛酸對(duì)照品(上海博頓生物化工有限公司)；濃硫酸、硼砂、間羥基聯(lián)苯等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

間羥基聯(lián)苯溶液的制備：稱(chēng)取間羥基聯(lián)苯0.15 g，精密稱(chēng)定，以0.5%NaOH溶液溶解，定容至100 mL，配制成約1.5 mg/mL的間羥基聯(lián)苯溶液，4 ℃冰箱中放置1個(gè)月，備用。

四硼酸鈉-硫酸溶液的制備：稱(chēng)取0.477 g 硼砂，精密稱(chēng)定，以濃H2SO4溶解，定容于100 mL量瓶中，制成0.012 5 mol/L的四硼酸鈉-硫酸溶液，備用。

D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制：稱(chēng)取105 ℃烘干至恒重的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品7 mg，精密稱(chēng)定，加蒸餾水使溶解，定容于100 mL的容量瓶中，配制成700 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中備用。

2.2 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密吸取D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5 mL置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，冰水浴冷卻，加四硼酸鈉-硫酸溶液5 mL，混勻，沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，加入間羥基聯(lián)苯溶液100 μL，渦旋振蕩5 min，室溫放置1 h后，于200～900 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。由掃描結(jié)果可知，D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品在525 nm處有最大吸光度，故選525 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 供試品溶液的制備

取瓜子金藥材，粉粹成粗粉，加8倍量無(wú)水乙醇85 ℃回流提取2次，每次1.5 h，過(guò)濾，藥渣揮干，加10倍量的蒸餾水95 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，濾液50 ℃減壓濃縮，濃縮液采用木瓜蛋白酶結(jié)合三氯乙酸法[6]脫蛋白，加乙醇至含醇量達(dá)80%(V/V)，靜置過(guò)夜，抽濾，真空干燥，得到瓜子金酸性多糖，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 精密吸取D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液10 mL置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，得70 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0 mL于25 mL具塞試管中，補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL，冰水浴冷卻，加四硼酸鈉-硫酸溶液5 mL，混勻，沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，加入間羥基聯(lián)苯溶液100 μL，渦旋振蕩5 min，室溫放置1 h，以蒸餾水為空白于525 nm測(cè)定吸光度，以D-半乳糖醛酸濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=0.012x-0.053，r=0.999 7(n=6)，結(jié)果表明，D-半乳糖醛酸濃度在7.0～70.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)圖1。

圖1 D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取40.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，按照“2.4.1”項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算吸光度的RSD值為0.513%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 配制50.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，各取1.0 mL入具塞試管中，按照“2.4.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定酸性多糖含量，計(jì)算吸光度的RSD為0.836%，表明該方法重現(xiàn)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取濃度為50.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，依“2.4.1”項(xiàng)下操作，每隔15 min測(cè)定吸光度一次，連續(xù)測(cè)定2 h，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.212%，表明樣品在2 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確精密稱(chēng)取樣品瓜子金酸性多糖(酸性多糖含量為4.62%)6份，每份約3.5 mg，分別加入濃度為52.5 μg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，依照“2.4.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，得平均回收率為99.8%，RSD=0.96%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，可見(jiàn)該方法具有良好的回收率。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由以上結(jié)果可知，該方案的精密性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)均穩(wěn)定良好，該實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定、成熟，可用于瓜子金多糖含量測(cè)定的進(jìn)一步研究。

2.5 瓜子金酸性多糖含量測(cè)定

取不同批次的瓜子金藥材，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備瓜子金酸性多糖，按照“2.4.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算瓜子金酸性多糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5瓜子金酸性多糖含量測(cè)定

3 討論

多糖是一類(lèi)由單糖聚合而成的高分子化合物，其具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗疲勞等作用[7-8]。在植物中不僅存在中性多糖還存在酸性多糖，酸性多糖是目前生物活性最多，應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)生物活性多糖，其結(jié)構(gòu)主要含有糖醛酸等基團(tuán)，具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、保肝等作用[9-12]。對(duì)于酸性多糖的含量測(cè)定常采用的方法有咔唑法和間羥基聯(lián)苯法[13]，本實(shí)驗(yàn)選用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定瓜子金酸性多糖的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的瓜子金酸性多糖的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好。

對(duì)不同批次的瓜子金藥材中酸性多糖的含量測(cè)定結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的瓜子金酸性多糖的含量測(cè)定方法科學(xué)可行，可用于瓜子金酸性多糖的含量測(cè)定。