孟舒獻(xiàn)，孟 洋，薛中博，馮 彤，馮亞青,

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2.天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

目前，近紅外熒光染料已經(jīng)在腫瘤診斷[1]、熒光成像、生物標(biāo)記以及非線性光學(xué)材料[2]等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，并越來越受到相關(guān)領(lǐng)域研究者的重視.近紅外熒光染料的吸收波長與發(fā)射波長均在650～900nm 左右，因此，其在傳播過程中受到的干擾較小，對物質(zhì)的穿透性能較強；尤其在醫(yī)藥生物學(xué)的活體標(biāo)本檢測中，其較大的波長有利于避開生物體內(nèi)的自發(fā)熒光，因此對組織細(xì)胞的滲透性增強，降低對生物體的損傷，在生物檢測、樣本分析、活體診斷等領(lǐng)域表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[3-6].

氟硼熒類(BODIPY)熒光染料是一種重要的近紅外熒光染料.德國化學(xué)家 Treibs等[7]于 1968年首次對 BODIPY熒光染料進(jìn)行了報道.1985年，帶有磺酸基團(tuán)的水溶性 BODIPY首次被發(fā)現(xiàn)后，氟硼熒類熒光染料逐漸引起了化學(xué)家的重視[8].近年來，BODIPY熒光染料因其優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)、較大的摩爾消光系數(shù)、較強的光穩(wěn)定性和易于修飾等優(yōu)點被廣泛用作近紅外熒光探針的發(fā)光基團(tuán)[9-11].

然而，BODIPY熒光染料也有其不足之處，Sibrian-Vazquez等[12]提出，目前大多數(shù) BODIPY 類熒光染料的吸收和發(fā)射波長小于 600 nm，處于可見光區(qū)域，并非真正意義上的近紅外 BODIPY熒光染料；除此之外，用于活體成像中的BODIPY熒光染料普遍具有較大的共軛芳香結(jié)構(gòu)，剛性較強，導(dǎo)致其水溶性與生物相容性差，嚴(yán)重限制了其在有機(jī)生命體中的應(yīng)用[13-14].

為了解決上述兩種難題，目前國內(nèi)外對BODIPY熒光染料的研究主要集中在以下兩個方面，其一是對BODIPY分子進(jìn)行修飾以增大其吸收與發(fā)射波長，主要包括：①在 3、5位引入共軛基團(tuán)以延長其共軛結(jié)構(gòu)[15]；②在β位進(jìn)行芳環(huán)共軛；③在2、3位與5、6位引入芳環(huán)基團(tuán)，擴(kuò)大共軛結(jié)構(gòu)；④在 2、6位引入炔基；⑤在meso位用N原子取代C原子以改變其電子推拉結(jié)構(gòu)等方法[16-20].其次，BODIPY熒光染料的水溶性問題，目前通常采用以下方法解決：①在核心骨架上引入親水基團(tuán)[21]；②與兩親性聚合物自組裝等[22-24].

本課題擬合成一種具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光染料，對BODIPY進(jìn)行化學(xué)修飾，使其最大吸收和發(fā)射波長均發(fā)生較大紅移，隨后利用靶向基團(tuán) RGD共價修飾的水溶性和生物相容性較好的磷脂分子與BODIPY進(jìn)行自組裝，進(jìn)而研發(fā)一種具有優(yōu)良熒光性能、近紅外發(fā)射波長較長、良好的靶向性與生物相容性的熒光探針分子，為發(fā)展新型的熒光性能優(yōu)異并具有良好的生物相容性的近紅外熒光探針提供新思路和新方法.

1 實 驗

1.1 實驗原料

卵磷脂、膽固醇，生物試劑，天津蘇斯泰來生物技術(shù)有限公司；2，4-二甲基吡咯、對甲酰基苯甲酸甲酯、三氟乙酸、2，3-二氯-5，6-二氰對苯醌(DDQ)、三氟化硼乙醚，分析純，天津希恩斯奧普德科技有限公司；二氯甲烷、石油醚、四氫呋喃，分析純，天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；二苯胺、對碘苯甲醛、醋酸鈀、雙[2-(二苯基膦基)苯基]醚、碳酸銫、18-冠-6醚，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；哌啶，分析純，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑研究所.所有化學(xué)藥品均未經(jīng)處理可直接使用.

1.2 實驗設(shè)備

Bruker DPX 500M 型核磁共振儀，瑞士 Bruker公司；Autoflex tof/tofIII 型基質(zhì)輔助激光解吸附-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，布魯克道爾頓公司；S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，Hitachi公司；Tecnai G2F20型場發(fā)射透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；ZS90納米粒度分析儀，馬爾文儀器有限公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀，Thermo Scientific公司；LB942型酶標(biāo)儀，Berthold Technologies公司；Ultra VIEM Vox型共聚焦顯微鏡，PerkinElmer公司.

1.3 實驗路線

1.3.1 8-對甲氧羰基苯基-1，3，5，7-四甲基氟硼二吡咯(Ⅰ)化合物的制備

氟硼二吡咯化合物骨架的合成參見文獻(xiàn)[25]，具體步驟如下：稱取對甲酰基苯甲酸甲酯 864mg(5.2 mmol)加入 100 mL單口燒瓶中，加入 32mL二氯甲烷溶液加入使其溶解，之后再量取 2，4-二甲基吡咯 1mL(10.0 mmol)加入.避光反應(yīng) 15min，N2鼓泡 0.5h，用來除去體系中的氧氣.之后，緩慢加入0.08 mL三氟乙酸，避光攪拌 4h，取 600mg DDQ(1.3 mmol)溶解于 5 mL二氯甲烷與 5 mL四氫呋喃混合溶液中，避光反應(yīng)1h后，量取8.6mL三乙胺逐滴加入，持續(xù)約 10 min，之后在冰浴環(huán)境中逐滴加入8.6 mL三氟化硼乙醚，0.5h后，撤去冰水浴，混合物于室溫下進(jìn)行磁力攪攔避光過夜反應(yīng).之后，將混合物水洗，二氯甲烷萃取，以CH2Cl2和PE體積比為 2∶1進(jìn)行硅膠柱層析分離，收集第 2條色帶，得到深色片狀晶體化合物Ⅰ，如圖1所示.

圖1 化合物Ⅰ的合成Fig.1 Synthesis of compoundⅠ

1.3.2 4-二芳胺基苯甲醛(Ⅱ)的合成

向裝有冷凝管的100 mL燒瓶中分別加入18-冠-6醚 670 mg(2.5 mmol)、二苯胺 423 mg(2.5 mmol)、醋酸鈀28 mg(125μmol)、對碘苯甲醛580 mg(2.5 mmol)、雙[2-(二苯基膦基)苯基]醚 68mg(125μmol)、碳酸銫 630mg(2.5 mmol)，在氬氣保護(hù)下，加入 15 mL四氫呋喃，緩慢加熱至回流，12h后終止反應(yīng).以二氯甲烷萃取，并收集有機(jī)相，以CH2Cl2和 PE體積比為1∶1.5的比例進(jìn)行柱層層析分離，收集第3條色帶，得到產(chǎn)品Ⅱ，如圖2所示.

圖2 化合物Ⅱ的合成Fig.2 Synthesis of compound Ⅱ

1.3.3 3，5-二(4-二苯胺基苯乙烯基)-8-對甲氧羰基苯基-1，7-二甲基氟硼二吡咯(Ⅲ)化合物的合成

分別稱取化合物Ⅰ76.4 mg(0.2 mmol)和化合物Ⅱ164mg(0.6 mmol)加入圓底燒瓶，之后加入 15 mL苯作溶劑，并向溶液中滴加 0.2 mL(2.0 mmol)哌啶和0.2 mL(3.4 mmol)冰乙酸，90℃下進(jìn)行回流反應(yīng)12h.待反應(yīng)終止后，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液，收集有機(jī)相，柱層析分離后，收集第 1條主要色帶，得到化合物Ⅲ，如圖3所示.

圖3 化合物Ⅲ的合成Fig.3 Synthesis of compound Ⅲ

1.3.4 DSPE-PEG2000-MAL-RGD的合成

將 2.5mg DSPE-PEG2000-MAL與 200μg RGD投入10 mL、pH值為7.4的PBS緩沖液中，在25℃氮氣保護(hù)下反應(yīng) 12h，然后用透析袋透析 3×24h除去未反應(yīng)的 RGD小分子，在冷凍干燥機(jī)中將溶劑凍干，得到白色固體，4℃下冷凍保存.

1.3.5 BODIPY-PC-RGD的合成

精確稱量 3mg卵磷脂、1mg化合物Ⅲ、2.5mg DSPE-PEG2000-MAL-RGD以及 1mg 膽固醇溶于30 mL的甲醇-氯仿溶液中(氯仿與甲醇的體積比為2∶1)，40℃下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中徹底除去氯仿與甲醇，直至其在燒瓶內(nèi)壁上形成一層脂質(zhì)薄膜.加入10 mL磷酸緩沖液(pH＝7.8)于燒瓶中，超聲 15min至溶液澄清，經(jīng) 0.45μm濾膜過濾制得 BODIPY-PCRGD溶液.在冷凍干燥機(jī)中將溶劑凍干，得到白色固體，4℃下冷凍保存.

1.4 分析測試

1.4.1 核磁共振氫譜(1HNMR)

采用核磁共振波譜儀表征化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ.溶劑為無內(nèi)標(biāo)的氘代氯仿(CDCl3).

1.4.2 BODIPY的熒光光譜測試

采用熒光分光光度計測試 BODIPY母核、化合物Ⅲ、BODIPY-PC-RGD 穩(wěn)態(tài)熒光光譜，以激發(fā)波長Em＝560nm進(jìn)行激發(fā)，設(shè)置測試參數(shù)統(tǒng)一為：激發(fā)電壓為700V，狹縫寬為5nm.

1.4.3 形貌測試

BODIPY-PC-RGD的形貌由場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)、場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)、普通光學(xué)顯微鏡與熒光顯微鏡表征.

1.4.4 細(xì)胞毒性實驗(MTT)

分別培養(yǎng) U87與Hela兩種細(xì)胞，并按 MTT實驗要求 96孔鋪板；制備不同濃度的 BODIPY、BODIPY-PC、BODIPY-PC-RGD(0.001μg/mL、0.01 μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，分別加入上述培養(yǎng)的兩種細(xì)胞中，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h后，加入 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4h后，每孔加入 100μL DMSO溶液使活細(xì)胞中的甲瓚晶體溶解.使用酶標(biāo)儀測試每個孔中細(xì)胞在490nm處的吸光度，數(shù)據(jù)處理按照式(1)進(jìn)行.

式中：V代表細(xì)胞存活率，%；Aexp代表實驗組細(xì)胞的吸光度；Acontrol代表空白對照組細(xì)胞的吸光度.

1.4.5 激光共聚焦實驗

按照細(xì)胞毒性實驗的方法進(jìn)行細(xì)胞鋪板，96孔板替換為48孔板，事先將48孔板細(xì)胞加入48孔板進(jìn)行爬片；將 48孔板放入?yún)?shù)為 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁；之后，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋好濃度的 BODIPY-PC與100μL BODIPY-PC-RGD 溶液(5μmol/L)，將 48 孔板放入?yún)?shù)為37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h；將含有樣品的培養(yǎng)基丟棄，加入 4%多聚甲醛 100μL，時長 5 min，固定細(xì)胞形態(tài)；用移液槍吸出4%多聚甲醛溶液，加入 DAPI溶液 100μL，歷時 10 min，進(jìn)行細(xì)胞核染色；之后吸棄 DAPI溶液，將爬片取出，并將其反面扣放在滴有 5μL防熒光淬滅封片劑的載玻片上，用共聚焦顯微鏡測試拍照，觀察其熒光特性.

1.4.6 流式細(xì)胞實驗

按照細(xì)胞毒性實驗的方法進(jìn)行細(xì)胞鋪板，并用 6孔板代替 96孔板，按照激光共聚焦實驗進(jìn)行樣品制備，在用流式儀測試上樣前，將樣品用 200目銅網(wǎng)進(jìn)行過濾.

2 結(jié)果與討論

2.1 3，5-二(4-二苯胺基苯乙烯基)-8-對甲氧羰基苯基-1，7-二甲基氟硼二吡咯(Ⅲ)化合物的合成

按第 1.3.3節(jié)的制備方法合成化合物Ⅲ.1HNMR(400 MHz，Chloroform-d)δ8.17(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.60(d，J＝16.2Hz，2H，—CH＝CH—)，7.42(m，6H，Ph-H)，7.27(t，J＝7.6Hz，8H，Ph-H)，7.20(d，J=16.3Hz，2H，—CH＝CH—)，7.14(d，J＝7.8Hz，8H，Ph-H)，7.10～7.00(m，8H，Ph-H)，6.62(s，2H，pyrrole-H)，3.40(s，3H，—COOCH3)，1.43(s，6H，pyrrole-CH3).MALDI-TOFMS：m/z calcd for C59H47BF2N4O2892.86，found 892.53 [M+].化合物Ⅲ的氫譜譜圖如圖4所示.

圖4 化合物Ⅲ的氫譜譜圖Fig.4 1HNMR spectra of compound Ⅲ

2.2 BODIPY的熒光光譜分析

為了研究所合成 BODIPY的光學(xué)性能，這里分別測試了BODIPY母核、所合成BODIPY(溶劑均為二氯甲烷)以及 BODIPY-PC-RGD(溶劑為去離子水)的熒光光譜，如圖 5所示.由圖 5可知，BODIPY母核的最大發(fā)射波長在 490 nm左右，而所合成的BODIPY最大發(fā)射波長在 680 nm，發(fā)生了明顯的紅移，這主要是因為 BODIPY母核 3、5位上所連接的供電子基團(tuán)形成推拉電子結(jié)構(gòu).另一方面，3、5位基團(tuán)的引入，使原BODIPY分子共平面性增強，這在一定程度上限制了由于結(jié)構(gòu)自由旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的非輻射能量損失，使其熒光波長從 490nm達(dá)到了近紅外區(qū)的680 nm.由圖 5(c)可知，當(dāng) BODIPY 的濃度相同時(40μg/mL)，組裝后的 BIDIPY-PC-RGD 相較組裝前的熒光強度略有降低，并且發(fā)生藍(lán)移，主要是因為用磷脂包覆后，BODIPY分子進(jìn)入磷脂形成的球囊的間隙中，空間較小，使得磷脂分子容易聚集，從而導(dǎo)致熒光猝滅，熒光強度下降.另一方面，經(jīng)磷脂包覆后，BODIPY染料外層有了一層磷脂屏障，阻礙了熒光的穿透，導(dǎo)致了熒光強度的下降.藍(lán)移的主要原因在于：BODIPY經(jīng)磷脂包覆后，其分子周邊的微環(huán)境極性升高，溶劑分子極化率增大，斯托克斯位移減小，導(dǎo)致藍(lán)移.

圖5 熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra

2.3 BODIPY與BODIPY-PC-RGD的形貌分析

圖 6(a)、(b)分別是 BODIPY 在 SEM 與 TEM中的圖像，圖 6(d)、(e)分別是 BODIPY-PC-RGD 在SEM 與 TEM 下的圖像.可以看出，單獨的 BODIPY顆粒大小不均一，表面粗糙，沒有特定的形狀，在水相中呈聚集狀態(tài)，片層較厚，堆積現(xiàn)象明顯，且片層表面有明顯的褶皺，無法測算其顆粒直徑.當(dāng)用磷脂將 BODIPY包覆后，發(fā)現(xiàn)探針顆粒均一，形狀規(guī)則，表面圓潤.圖 6(c)是 BODIPY在水相中光學(xué)顯微鏡下的圖像，BODIPY在水相中呈棕綠色，分散混亂，沒有特定的形狀，當(dāng)用磷脂包覆后發(fā)現(xiàn)，BODIPY-PCRGD在水相中分散較為均勻，并且 BODIPY-PCRGD呈淺綠色說明磷脂將 BODIPY成功包覆.接著，又測試了 BODIPY-PC-RGD的粒徑，如圖 7所示，其粒徑分布較為均一，為(143±20)nm.

圖6 BODIPY與BODIPY-PC-RGD的形貌表征Fig.6 Morphologies of BODIPY and BODIPY-PC-RGD

圖7 BODIPY-PC-RGD的粒徑分布Fig.7 Size distribution of BODIPY-PC-RGD

為了進(jìn)一步確認(rèn) BODIPY-PC-RGD的成功包覆，這里使用熒光顯微鏡檢測了其在水相中的熒光性質(zhì)與形貌，如圖8所示.圖8(a)是有機(jī)相中BODIPY在熒光顯微鏡下的圖像，可以看出其發(fā)橘紅色熒光，且形狀不規(guī)則，大小不均一，圖 8(b)是水相中BODIPY-PC-RGD在熒光顯微鏡下的圖像，其發(fā)出的熒光與圖 8(a)相比較弱，且呈球狀分布，大小均一，說明BODIPY-PC-RGD的成功制備.

圖8 BODIPY與 BODIPY-PC-RGD熒光顯微鏡下的圖像Fig.8 Fluorescence images of BODIPY and BODIPYPC-RGD

2.4 BODIPY、BODIPY-PC、BODIPY-PC-RGD的細(xì)胞毒性分析

這里分別測試了 48h BODIPY、BODIPY-PC和BODIPY-PC-RGD在不同質(zhì)量濃度0.001μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL下對 U87與 Hela兩種細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖 9所示，結(jié)果表明，在低濃度時，BODIPY-PCRGD對細(xì)胞無毒害作用，當(dāng)質(zhì)量濃度上升到100μg/mL，無論是 U87還是 Hela細(xì)胞，依然有近90%以上的存活率，同時，可以發(fā)現(xiàn)，在一系列濃度梯度下，與單獨的 BODIPY相比，磷脂包覆后的BODIPY毒性明顯降低，因此，在實驗所需濃度范圍(低濃度)內(nèi)，BODIPY-PC-RGD可以視為不具有任何細(xì)胞毒性，可以將其用于生物體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步研究.

圖9 MTT實驗結(jié)果Fig.9 Results of MTT

2.5 共聚焦顯微鏡對細(xì)胞靶向性的測試結(jié)果

整合素 αVβ3在一些腫瘤細(xì)胞表面會進(jìn)行特異性表達(dá)，而RGD多肽具有與αVβ3受體發(fā)生特異性結(jié)合的特性，因此，利用這一性質(zhì)，讓探針被帶有靶向基團(tuán)RGD的磷脂包覆，然后選擇整合素αVβ3含量不同的細(xì)胞來對其靶向性進(jìn)行檢測.

為了確定 BODIPY-PC-RGD對于腫瘤細(xì)胞是否具有靶向性，這里選擇了兩種細(xì)胞 U87(整合素高表達(dá))、Hela(整合素低表達(dá))進(jìn)行靶向性測試.如圖 10所示，發(fā)藍(lán)色熒光的是兩種細(xì)胞的細(xì)胞核，這是由于DAPI染料對細(xì)胞核染色的結(jié)果；BODIPY在560nm的激發(fā)光下可以發(fā)出紅色的熒光，因此可以通過紅色熒光的強弱來判斷探針與細(xì)胞結(jié)合的數(shù)量，進(jìn)一步驗證 BODIPY-PC-RGD的靶向性.通過實驗結(jié)果可以看出，不具備靶向基團(tuán) RGD的 BODIPY-PC，在兩種細(xì)胞中均表現(xiàn)出極弱甚至沒有熒光，而具有靶向基團(tuán)的 BODIPY-PC-RGD，則均可在兩種細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯的紅色熒光.另外，整合素高表達(dá)的細(xì)胞U87在熒光顯微鏡下展現(xiàn)出很亮的熒光，而整合素相對較低表達(dá)的 Hela則熒光強度比較弱，這也證明了帶有靶向基團(tuán)的磷脂具有靶向性，包覆 BODIPY染料后整體顯示出明顯的靶向性.

圖10 U87細(xì)胞和Hela細(xì)胞共聚焦顯微鏡圖像Fig.10 Fluorescence images of U87 and Helain vitro

2.6 流式細(xì)胞實驗測試結(jié)果

流式細(xì)胞實驗是一種通過檢測探針到達(dá)細(xì)胞數(shù)量并定量對探針靶向性進(jìn)行測定的一種手段.如圖11所示，對于整合素較少的 Hela細(xì)胞，BODIPY、BODIPY-PC、BODIPY-PC-RGD 3者的熒光強度變化較少，說明探針到達(dá)細(xì)胞的數(shù)量較少；而對于整合素較多的 U87細(xì)胞，BODIPY-PC-RGD探針明顯發(fā)生了右移.另外，無論是Hela細(xì)胞還是U87細(xì)胞，帶有靶向基團(tuán)的探針熒光強度均較無靶向基團(tuán)的探針有較明顯右移，該結(jié)論與上述共聚焦顯微鏡實驗結(jié)論一致，進(jìn)一步說明 BODIPY-PC-RGD對整合素高的腫瘤細(xì)胞具有良好的靶向作用.

圖11 流式細(xì)胞實驗測定結(jié)果Fig.11 Cell viability experimental results

3 結(jié) 語

氟硼類染料由于其良好的光學(xué)性能被廣泛用作熒光探針的發(fā)光基團(tuán)，但因其生物相容性、水溶性差而限制了其在生物體中的應(yīng)用.為此，本文用接有靶向基團(tuán)RGD的磷脂對BODIPY進(jìn)行包覆，在解決了BODIPY難溶于水的難題的同時，增強了其在生物體內(nèi)的靶向能力，通過細(xì)胞毒性實驗、共聚焦實驗以及流式細(xì)胞實驗，證實了該 BODIPY-PC-RGD復(fù)合物具有良好的生物相容性以及腫瘤靶向性，表示這種復(fù)合物在未來腫瘤檢測及診斷領(lǐng)域具有長遠(yuǎn)的發(fā)展?jié)摿?