姚芳蓮，羅巧悅，郭 旗，田 亮，李俊杰

(天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350)

羥基磷灰石(HAp)是天然骨的主要無機礦物組成部分，無細胞毒性，能支持多種細胞的黏附和生長.相比于微米級 HAp，納米 HAp的可塑性得到明顯提升，降解速率得到明顯改善.此外，納米HAp的比表面積比較高，利于提高細胞附著、生長行為[1-3].然而，純的 HAp納米顆粒穩(wěn)定性差，容易發(fā)生團聚，形成較大的顆粒，失去納米材料的特性，致使其細胞攝取困難，同時這種聚集行為在體內(nèi)應(yīng)用時容易引發(fā)血管堵塞，使其體內(nèi)的應(yīng)用受到很大的限制[4-5].因此，對 HAp納米顆粒進行修飾，提高 HAp的穩(wěn)定性，減少團聚現(xiàn)象的發(fā)生，是推進其在生物醫(yī)用方面應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一[6-7].

果膠是一種富含半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯單元的天然多糖，是植物的骨骼組織，其結(jié)構(gòu)與哺乳動物細胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的多糖相似.果膠具有良好的生物相容性，而且能夠在體內(nèi)有效降低血糖和膽固醇含量[8]，近年來已在生物醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[9].此外，由于其高分子質(zhì)量和聚陰離子本質(zhì)屬性，果膠可與金屬陽離子發(fā)生反應(yīng)，形成物理動態(tài)的物理交聯(lián)結(jié)構(gòu).例如，Dutta等[10]通過果膠與Ca2+交聯(lián)形成納米粒，成功將 Fe3O4和奧沙利鉑藥物包載到其中，構(gòu)建了載藥納米粒子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該載藥納米粒對負載藥物具有明顯的緩控釋放作用.本課題組也成功在殼聚糖/果膠聚電解質(zhì)配合物中形成 HAp，結(jié)果顯示該 HAp體系可調(diào)控細胞的黏附和生長，相比微米級HAp表面，納米級HAp表面更能促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[11]，為 HAp基骨組織工程用支架材料的研制提供了一條可行性途徑.

本文利用果膠分子鏈上羧基與金屬離子的絡(luò)合能力，原位制得 HAp與果膠的復(fù)合納米粒子(HAp@pectin)，從分子水平上系統(tǒng)研究了HAp@pectin體系中果膠與 HAp特征基團之間的相互作用關(guān)系，研究結(jié)果可為 HAp納米復(fù)合材料在骨組織修復(fù)及藥物遞送基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 實 驗

1.1 HAp@pectin復(fù)合納米粒的制備

將 0.1 g果膠加入 50 mL去離子水中，加熱至55℃，磁力攪拌直至全部溶解.用單通道注射泵以30 mL/h的速率將 CaCl2溶液(0.02mol/L)加入其中.滴加停止后繼續(xù)攪拌 1h，并以相同的速率將Na2HPO4溶液(6 mL，0.15 mol/L)加入上述果膠鈣體系中，繼續(xù)反應(yīng) 20h，降至室溫.在 9000r/min下離心分離，用去離子水沖洗3次，得到白色固體HAp@pectin.然后將其分散在 30mL去離子水中，最終獲得淡藍色的HAp@pectin浮液.

1.2 HAp@pectin粒徑和Zeta電位表征

取 5mL HAp@pectin納米粒分散液，用激光粒度儀(Malvern Nano Zeta)測量 173°處 HAp@ pectin的粒徑大小及分散指數(shù)(PDI).同時測定HAp@pectin納米粒子分散液的Zeta電位.檢測溫度為25℃，樣品測量3次取平均值.

1.3 HAp@pectin復(fù)合納米粒形貌觀察

用滴管取少許HAp@pectin納米粒分散液，滴加到帶有支持膜的銅網(wǎng)上，用透射電鏡(JEOL型)觀察其形貌.

1.4 紅外光譜分析

取HAp@pectin復(fù)合物及果膠原料，與KBr混合研磨后壓片，采用紅外光譜儀(Nicolet Magna-560)表征.在 4000～500cm-1范圍內(nèi)進行掃描 32次，記錄其傅里葉變換紅外光譜(FT-IR).

1.5 X射線衍射分析

將 HAp@pectin納米復(fù)合物用瑪瑙缽研磨.在Rigaku D/max2500 v/pc型X射線衍射儀上分析其晶體結(jié)構(gòu)，掃描速率為 10°/min，掃描范圍為 20°～70°，Cu Kα輻射，管電流為200mA，管電壓為40kV.

1.6 熱失重分析

分別稱取5mg HAp@pectin及果膠，用綜合熱分析儀(ZRP-2P)在空氣氣氛中檢測其失重行為，掃描范圍為50～800℃，升溫速率為10℃/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 HAp@pectin復(fù)合納米粒的制備分析

果膠分子鏈上含有大量的羧基，其可與 Ca2+發(fā)生配位絡(luò)合反應(yīng)形成果膠鈣凝膠(見圖1).交聯(lián)密度是控制該體系凝膠狀態(tài)的關(guān)鍵因素，可以通過改變體系中 Ca2+的加入量，精確控制果膠鈣凝膠的交聯(lián)密度.先前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) Ca2+與果膠結(jié)構(gòu)單元的物質(zhì)的量比為1∶50時，恰好達到預(yù)凝膠狀態(tài)[12].

圖1 果膠與不同濃度 Ca2+反應(yīng)時形成凝膠及微凝膠結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Formations of hydrogel and microgel via the reactions between pectin and Ca2+ with different concentrations

本實驗也發(fā)現(xiàn)當(dāng)果膠分子鏈上羧基與 Ca2+的物質(zhì)的量比為50∶1時，果膠鈣體系可以形成穩(wěn)定的微凝膠分散液.若將 PO43-引入果膠鈣分散液中，則因為磷酸鈣鹽沉淀物的生成，原本與鈣離子結(jié)合的果膠分子中的羧基將逐漸被 PO43-所取代，磷酸鈣鹽通過聚集、結(jié)晶而成核，果膠分子進一步吸附在磷酸鈣晶體表面，最終形成具有核殼結(jié)構(gòu)的HAp@pectin復(fù)合納米粒(見圖2).

圖2 通過預(yù)凝膠方法原位形成 HAp@pectin納米粒的示意Fig.2 Schematic of the formation process of HAp@pectin nanoparticles via the pre-gel method

在上述HAp@pectin復(fù)合納米粒的形成過程中，體系中 Ca2+與 PO43-的加入量不同，所得復(fù)合納米粒中，磷酸鈣鹽的組成和晶體結(jié)構(gòu)將會有明顯的差別.圖 3所示為加入不同量的 PO43-時，所形成的HAp@pectin的透射電鏡照片.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鈣磷比(鈣與磷物質(zhì)的量的比)為 1∶9時，PO43-極大過量，所得 HAp@pectin復(fù)合粒子全部呈現(xiàn)針狀晶體(見圖3(a))；當(dāng)鈣磷比為 2∶9時，產(chǎn)物則以球形的HAp@pectin納米粒為主(見圖 3(b))，而且在其表面觀察到明顯的果膠層；而當(dāng) PO43-的加入量進一步降低至鈣磷比為 4∶9時，復(fù)合材料為針狀晶體與球形納米粒共存(見圖 3(c)).圖 4為不同鈣磷比時HAp@pectin形成過程示意.分析 HAp@pectin復(fù)合納米粒的形成過程，其中主要包括的反應(yīng)過程為：①PO43-在滲透壓的驅(qū)動下，擴散進入果膠鈣微凝膠中；②PO43-與果膠鈣凝膠中的鈣離子在微凝膠中相遇，生成磷酸鈣鹽，由于其相對強的相互作用力，Ca2+與果膠分子中羧酸根的結(jié)合能力下降，從其表面脫落；③以形成的磷酸鈣鹽為核，隨著 PO43-的加入并逐漸聚集成磷酸鈣晶體；④自由的果膠分子重新在溶液體系中排列并通過物理、靜電作用附著于磷酸鈣晶體表面.表1列出了不同鈣磷比對HAp@pectin納米粒子尺寸和Zeta電位的影響，所有粒子的Zeta電位均為負值，進一步證明上述納米粒子的形成過程.

圖3 不同鈣磷比HAp@pectin 納米粒的形貌Fig.3 TEM images of HAp@pectin nanoparticles with various molar ratios of calcium and phosphorus

圖4 不同鈣磷比條件下HAp@pectin形成過程示意Fig 4 Formation process of HAp@pectin with different molar ratios of calcium and phosphorus

表1 不同鈣磷比對 HAp@pectin納米粒子尺寸和 Zeta電位的影響Tab.1 Effects of various molar ratios of calcium and phosphorus on the particle sizes and Zetapotentials

2.2 HAp@pectin體系中HAp核晶體結(jié)構(gòu)分析

圖5給出了HAp和HAp@pectin的X射線衍射圖譜，兩種物質(zhì)均在 2θ為 25.8°(002)、31.8°(211)、32.9°(300)、39.8°(310)、49.5°(213)和 53.2°(004)處出現(xiàn)了 HAp晶體的特征衍射峰，這些特征衍射峰與HAp的 ICDD標(biāo)準卡片一致，說明在水溶液狀態(tài)和果膠鈣凝膠體系中均可以形成 HAp晶體，果膠的引入和體系黏度的增加沒有影響 HAp晶體的形成.但是，HAp@pectin的衍射峰強度明顯低于 HAp，說明pectin的引入降低了HAp的結(jié)晶度.根據(jù)謝樂公式，晶體大小與衍射峰的半峰寬相關(guān)，半峰寬越大所表示的晶體粒徑越小.特別是在果膠存在的條件下，其形成的HAp的各處的半峰寬均比純HAp大，即粒徑減小.主要原因是果膠中 —COOH使 Ca2+在果膠分子上吸附，形成相對較多成核位點，果膠與鈣離子的結(jié)合能力強，導(dǎo)致游離鈣離子濃度下降最大，所以HAp晶體的生長比較慢，形成的粒徑較小，衍射峰比較寬[13].

圖5 Hap與HAp@pectin的X射線衍射圖譜Fig.5 XRD patterns of HAp and HAp@pectin

2.3 HAp@pectin體系中分子間相互作用

采用 FT-IR探索了 HAp@pectin體系中特征官能團間的相互作用關(guān)系，如圖6所示，3437cm-1處出現(xiàn)的吸收譜帶為果膠分子鏈上糖環(huán)中羥基的特征吸收峰，1739cm-1與 1632 cm-1分別為果膠分子結(jié)構(gòu)中—COOH和酯基上—C＝O的特征吸收峰.與果膠相比，HAp@pectin在 1025cm-1處出現(xiàn)了 P＝O的強吸收峰，607cm-1和576cm-1吸收峰歸屬于HAp的P—O單鍵，這些特征吸收峰的出現(xiàn)都證明了HAp在果膠凝膠中形成，與XRD測試結(jié)果一致.另外，與果膠的 FT-IR相比，1739cm-1處游離羧酸的吸收峰在HAp@pectin復(fù)合中消失，這是由于在HAp@pectin中 COO-與鈣離子發(fā)生作用形成羧酸鹽[14].同時在 1550cm-1及 1400cm-1可以觀察到兩個羧酸鹽中羰基的吸收峰，而 2934cm-1處吸收譜帶的吸收強度減弱，表明果膠分子中的羧基與 HAp分子間存在著較強的相互作用，是 HAp在果膠凝膠中形成的主要驅(qū)動力，這一過程與天然骨在膠原纖維上礦化的機理相似，也是通過控制體系中果膠的含量調(diào)控HAp的形成過程和晶體形貌特征的主要理論依據(jù).

圖6 果膠與HAp@pectin的紅外譜圖Fig.6 FT-IR spectra of pectin and HAp@pectin

2.4 HAp@pectin納米復(fù)合體系的TGA分析

圖7 HAp@pectin的透射電鏡照片和果膠與HAp@pectin的熱重分析曲線Fig.7 TEM image of HAp@pectin and TGA curves of pectin and HAp@pectin

圖7(a)為HAp@pectin復(fù)合納米顆粒的TEM照片，可以明顯觀察到其中的核-殼結(jié)構(gòu).為了進一步分析 HAp@pectin中 HAp與果膠的相對含量，對其進行了TGA測試(見圖7(b))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，果膠及 HAp@pectin的質(zhì)量下降，根據(jù)失重情況可以算出 HAp@pectin復(fù)合體系中果膠的質(zhì)量分數(shù)為 14.46%.果膠升溫過程中的失重主要分為 3個階段：第 1階段主要是脫水過程，包括果膠分子之間的酯化反應(yīng)生成的水及游離水的脫出；第2階段為羧基分解放出二氧化碳；第3階段則可能對應(yīng)分子鏈上大量—OH的脫落.

3 結(jié) 語

利用果膠分子中羧基與 Ca2+的靜電作用，成功制備了HAp@pectin復(fù)合納米粒子，明確了復(fù)合體系中的分子相互作用規(guī)律及果膠組分對HAp形貌的調(diào)控作用規(guī)律.結(jié)果顯示在果膠分子鏈上的羧基與 Ca2+配位反應(yīng)的驅(qū)動下，控制鈣磷比為 1∶50時，制得了穩(wěn)定分散羧酸鈣納米凝膠.進一步將 Na2HPO4溶液加入果膠鈣納米凝膠分散液中，原位合成了HAp@pectin復(fù)合納米粒.通過調(diào)節(jié)Na2HPO4的加入量，可以控制復(fù)合納米粒的形貌及尺寸，當(dāng)加入的鈣磷比為2∶9時，復(fù)合納米粒呈現(xiàn)球狀.借助FT-IR分析證明了 HAp與果膠分子間存在著較強的相互作用.研究結(jié)果將為羥基磷灰石與多糖復(fù)合材料制備提供一定的理論基礎(chǔ)，并拓寬其在組織工程和藥物遞送中的應(yīng)用.