李珊珊 顧文超

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。據(jù)估計(jì)，2018 年全球新增病例為2093876 例，死亡人數(shù)為1761007 人［1］。肺癌的主要組織學(xué)亞型是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），主要包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，約占肺癌的80%［2］。雖然近年來NSCLC 的臨床治療取得了越來越多的進(jìn)展，但NSCLC患者的總體生存時(shí)間并未顯著提高。因此，揭示非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機(jī)制，以開發(fā)新的非小細(xì)胞肺癌治療策略具有重要意義。近年來，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）因其豐富的調(diào)控手段在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中的作用越來越受到重視，其中長鏈非編碼RNA（lncRNA），一類長度＞200 個(gè)核苷酸、編碼能力有限的非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，逐漸引起了人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，在生物過程發(fā)揮重要作用，包括生長、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和侵襲，發(fā)揮促癌或者抑癌基因的重要作用［3］。一些lncRNA 被報(bào)道在NSCLC 中具有致癌或抑制腫瘤的作用［4-5］。lncRNA OR3A4 是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在乳腺癌和胃癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展［6］。然而，lncRNA OR3A4 在NSCLC 中的表達(dá)、作用及作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討RNA OR3A4 在NSCLC 中的作用和機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本和倫理聲明 在患者知情同意的情況下，經(jīng)浦東新區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)按照國際標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)，從浦東新區(qū)人民醫(yī)院獲得30 對NSCLC 組織及相鄰非癌性肺組織樣本。另外，10 例NSCLC 骨轉(zhuǎn)移組織也取自浦東新區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)的NSCLC 患者。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。組織標(biāo)本冷凍保存于- 80℃冷凍箱。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人NSCLC 細(xì)胞株（A549、SPC-A1、H1299 和SK-MES-1）和HEK293T 細(xì) 胞 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），PC-9 細(xì)胞和人支氣管上皮（HBE）細(xì)胞購自ATCC（馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國）。用DMEM 或RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCLC 細(xì)胞株。使用Lipofectamine 2000 按照制造商的協(xié)議進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR 分析 使用TRIzol?試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA。采用PrimeScript?RT 試劑試劑盒（TaKaRa，大連，中國）合成互補(bǔ)DNA，采用SYBR預(yù)混料Ex Taq II（TaKaRa）進(jìn)行qRT-PCR 分析。β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化的對照。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對基因表達(dá)水平。

1.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 用RIPA 緩沖液制備細(xì)胞裂解液。在10%凝膠上用SDS-PAGE 分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉1h。在4℃下用一級(jí)抗體將細(xì)胞膜培養(yǎng)過夜。使用的主要抗體如下：KLF6（Proteintech，武漢，中國）和β-actin（Proteintech）。將二抗37℃孵育1h 后，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測觀察條帶。

1.5 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 針對（shOR3A4）和陰性對照（shCtrl）的特異性shRNA 寡核苷酸購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。將編碼OR3A4 的互補(bǔ)DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后插入pcDNA3.1（Invitrogen）中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000 進(jìn)行。

1.6 細(xì)胞增殖檢測 使用CCK-8 試劑盒評(píng)估細(xì)胞增殖能力。在96 孔板中每孔接種2000 個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)（接種后1d、2d、3d 和4d）檢測細(xì)胞活力。在490nm 處用分光光度微平板閱讀器測定吸光度。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6 孔板（1×103/孔）中，連續(xù)培養(yǎng)10d。更換培養(yǎng)基1 次/3d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.7 細(xì)胞凋亡測定 采用Annexin V-Alexa Fluor 647/ PI 凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用膠原酶消化，收集細(xì)胞，用annexin V-Alexa Fluor 647 和PI在室溫下染色15min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 細(xì)胞培養(yǎng)基。12h 后，用棉簽取出細(xì)胞膜上表面的細(xì)胞。然后用甲醛固定下層細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色30min。遷移細(xì)胞的數(shù)量在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將各室加入稀釋后的基底基質(zhì)凝膠37℃下聚合30min。轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 細(xì)胞培養(yǎng)基。這些細(xì)胞被允許進(jìn)入下膜24h。隨后，用棉簽取出細(xì)胞膜上表面的細(xì)胞。然后用甲醛固定下層細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色30min。在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)。

1.10 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是在動(dòng)物研究機(jī)構(gòu)委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行的，嚴(yán)格按照美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南中的建議。雌性athymic BALB/c 小鼠（5 周齡）購自河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（鄭州，中國），在特定的無致病性條件下培養(yǎng)。將穩(wěn)定表達(dá)shCtrl 或shOR3A4 的A549 細(xì)胞（1×106）或穩(wěn)定表達(dá)Ctrl 或OR3A4 的H1299 細(xì)胞（1×106）皮下注射于裸鼠側(cè)翼兩側(cè)（n=6 只/組）。測量腫瘤體積1 次/5d，計(jì)算公式為體積=（長×寬×0.5）。25d 后小鼠被處死，并對腫瘤進(jìn)行稱重。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism（Version 5.0，GraphPad Software，Inc）軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OR3A4 在NSCLC 細(xì)胞系和組織中表達(dá)上調(diào) 為了探討OR3A4 在NSCLC 中的作用，采用qRT-PCR檢測了30 對NSCLC 組織樣本及相鄰非癌性肺組織中OR3A4 的表達(dá)情況。OR3A4 在NSCLC 組織標(biāo)本中的表達(dá)明顯高于鄰近非癌性肺組織標(biāo)本（P＜0.05）（見圖1A）。此外，作者收集了10 例NSCLC 骨轉(zhuǎn)移組織，并測定了OR3A4 的表達(dá)。結(jié)果顯示OR3A4 在骨轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)高于原發(fā)性NSCLC 組織（P＜0.05）（見圖1B）。此外，與HBE 細(xì)胞比較，OR3A4 在NSCLC 細(xì)胞 株（A549、SPC-A1、PC-9、SK-MES-1 和H1299）中的表達(dá)較高（P＜0.05）（見圖1C）。

圖1 OR3A4在NSCLC組織樣本和細(xì)胞系中上調(diào)。A：OR3A4在30對NSCLC和非癌性肺組織樣本中的表達(dá)的定量分析，與正常相比較，＊P＜0.05。B：OR3A4在30個(gè)原發(fā)性NSCLC組織和10個(gè)骨轉(zhuǎn)移組織樣本中的表達(dá)的定量分析，與原發(fā)性NSCLC比較，＊P＜0.05。C：定量OR3A4在NSCLC細(xì)胞系和正常HBE細(xì)胞中的表達(dá)，與HBE組比較，＊P＜0.05。

2.2 下調(diào)OR3A4 表達(dá)抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移 為了研究OR3A4 在NSCLC 中的作用，使用shRNA 下調(diào)了OR3A4 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)。qRTPCR 驗(yàn)證了基因沉默的有效性（見圖2A）。用CKK-8法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測定了A549 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，下調(diào)OR3A4 表達(dá)可顯著抑制A549 細(xì)胞的增殖速率（見圖2B）。菌落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，下調(diào)OR3A4 的A549 細(xì)胞形成的菌落明顯減少（見圖2C）。作者用流式細(xì)胞術(shù)測定了OR3A4的下調(diào)對A549 細(xì)胞凋亡的影響。如圖2D 所示，在A549 細(xì)胞中，OR3A4 敲低顯著增加了凋亡細(xì)胞的百分比。然后在體外評(píng)估了OR3A4 敲低對NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，OR3A4 敲低組的細(xì)胞遷移更少（見圖2E）。此外，基質(zhì)凝膠侵入的結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明，OR3A4 敲低也抑制了A549 細(xì)胞的侵襲能力（見圖2F）。

圖2 OR3A4敲低抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。A：qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染shCtrl 和shOR3A4的A549細(xì)胞中OR3A4的表達(dá)。B：采用CCK-8法測定shCtrl 和shOR3A4兩組的細(xì)胞增殖能力。C：檢測shCtrl 和shOR3A4兩組的細(xì)胞克隆形成能力。D：流式細(xì)胞術(shù)分析shCtrl和shOR3A4轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的凋亡情況。E：采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測下調(diào)OR3A4表達(dá)后A549細(xì)胞的遷移能力。F：采用基質(zhì)凝膠侵襲法對轉(zhuǎn)染shOR3A4的 A549細(xì)胞進(jìn)行侵襲性檢測。與ShCtrl組比較，＊P＜0.05。

2.3 上調(diào)OR3A4 表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移 使用pcDNA3.0 上調(diào)了OR3A4 在NSCLC 細(xì)胞中的表達(dá)。qRT-PCR 驗(yàn)證了基因沉默的有效性（見圖3A）。用CKK-8 法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測定了H1299細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明，上調(diào)OR3A4 表達(dá)可明顯促進(jìn)H1299 細(xì)胞的增殖速率（圖3B）。菌落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，上調(diào)OR3A4 的H1299 細(xì)胞形成的菌落明顯增加（見圖3C）。作者用流式細(xì)胞術(shù)測定了OR3A4 的上調(diào)對H1299 細(xì)胞凋亡的影響。（如圖3D）所示，在H1299 細(xì)胞中，OR3A4 過表達(dá)顯著降低了凋亡細(xì)胞的百分比。然后在體外評(píng)估了OR3A4過表達(dá)對NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，OR3A4 過表達(dá)組的細(xì)胞遷移增加（見圖3E）。此外，基質(zhì)凝膠侵入的結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明，OR3A4 過表達(dá)也促進(jìn)了H1299 細(xì)胞的侵襲能力（見圖3F）。

2.4 下調(diào)OR3A4 表達(dá)抑制NSCLC 腫瘤生長，但上調(diào)其表達(dá)促進(jìn)NSCLC 腫瘤生長 為進(jìn)一步證實(shí)OR3A4在NSCLC 中的生物學(xué)作用，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shCtrl 或shOR3A4 的A549 細(xì)胞，或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ctrl 或OR3A4的H1299 細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。測量腫瘤體積1次/5d，并進(jìn)行腫瘤注射25d 后稱重。結(jié)果表明，與shCtrl 組比較，OR3A4 的下調(diào)顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長，包括平均腫瘤體積（見圖4A）和體重（見圖4B）；OR3A4 的上調(diào)明顯促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長，包括平均腫瘤體積（見圖4C）和體重（見圖4D）。

圖3 OR3A4過表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。A：qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染OR3A4過表達(dá)質(zhì)粒以及空白質(zhì)粒的H1299細(xì)胞中OR3A4的表達(dá)。B：采用CCK-8法測定Ctrl和OR3A4轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力。C：檢測Ctrl 和OR3A4兩組的細(xì)胞克隆形成能力。D：流式細(xì)胞術(shù)分析Ctrl和OR3A4轉(zhuǎn)染的H1299細(xì)胞的凋亡情況。E：采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)OR3A4表達(dá)后H1299細(xì)胞的遷移能力。F：采用基質(zhì)凝膠侵襲法對轉(zhuǎn)染OR3A4過表達(dá)質(zhì)粒的 H1299細(xì)胞進(jìn)行侵襲性檢測。與Ctrl組比較，＊P＜0.05。

圖4 下調(diào)OR3A4抑制NSCLC腫瘤生長，上調(diào)OR3A4則促進(jìn)NSCLC腫瘤生長。A：將穩(wěn)定表達(dá)shCtrl或shOR3A4的A549細(xì)胞皮下注射于裸鼠，測量腫瘤體積1次/5d。B：腫瘤重量。C：將穩(wěn)定表達(dá)Ctrl或OR3A4的H1299細(xì)胞皮下注射于裸鼠，測量腫瘤體積1次/5d。D：腫瘤重量。與Ctrl組比較，＊P＜0.05。

2.5 OR3A4 通過抑制KLF6 表達(dá)影響NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)功能 已有報(bào)道OR3A4 通過抑制KLF6 促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移［7］。KLF6 在NSCLC 中具有抑癌作用［8］。因此，作者首次研究OR3A4 是否也調(diào)控NSCLC 中KLF6的表達(dá)，以及OR3A4 在NSCLC 中的致癌作用是否依賴于KLF6 的調(diào)控。采用qRT-PCR 和western blot 檢測KLF6 在OR3A4 穩(wěn)定過表達(dá)的H1299 細(xì)胞和OR3A4敲低的A549 細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示KLF6 過表達(dá)下調(diào)了PXN mRNA 和蛋白水平，而敲低OR3A4 表達(dá)后上調(diào)PXN mRNA 和蛋白水平。另外，在OR3A4 過表達(dá)的H1299 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF6 過表達(dá)載體明顯抑制了OR3A4 對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的促進(jìn)作用，而在shOR3A4 敲低的H1299 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF6 敲低載體顯著抑制了OR3A4 對細(xì)胞增殖的抑制作用。提示OR3A4 在NSCLC 中的促癌作用至少部分依賴于KLF6的負(fù)向調(diào)控。

3 討論

在過去的十年中，各種lncRNA 被發(fā)現(xiàn)在癌癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［9-10］。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)OR3A4 在NSCLC 組織和細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。OR3A4 過表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而下調(diào)OR3A4 表達(dá)則抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移侵襲和腫瘤生長。另外，進(jìn)一步證明了OR3A4 在NSCLC 中的作用可能通過抑制KLF6 表達(dá)。結(jié)果表明OR3A4 在NSCLC 中發(fā)揮致癌作用。

本資料數(shù)據(jù)表明，OR3A4 的表達(dá)上調(diào)可能有助于NSCLC 的進(jìn)展，這在其他癌癥中也有類似的發(fā)現(xiàn)。Li等［11］證明OR3A4 通過調(diào)控AGGF1/akt/mTOR 通路參與肝細(xì)胞癌血管生成，證實(shí)OR3A4 是肝癌進(jìn)展和血管生成的促進(jìn)劑。在胃癌中，過表達(dá)OR3A4 促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長，血管生成和轉(zhuǎn)移，并且證明了OR3A4 通過調(diào)節(jié)PDLIM2、MACC1、NTN4、GNB2L1 的活化，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)功能［6］。OR3A4 在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。此外，OR3A4 基因在體外敲除后，細(xì)胞遷移和侵襲受到明顯抑制［7］。此外，在乳腺癌中，OR3A4 在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并與臨床病理特征相關(guān)。下調(diào)OR3A4 表達(dá)通過影響細(xì)胞周期和凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并通過EMT 抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，過表達(dá)OR3A4 取得相反實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，OR3A4 是一種潛在的診斷生物標(biāo)志物和治療目標(biāo)的各種癌癥。

大量研究表明，KLF6 可以作為腫瘤抑制因子，調(diào)控增殖、遷移、分化、凋亡、細(xì)胞周期和血管生成等多種基本細(xì)胞功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生［12］。KLF6通過下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物和抑制MMP-9 活性，抑制口腔癌的遷移和侵襲。KLF6 通過轉(zhuǎn)錄抑制E2F1 抑制透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。Guo 等［7］指出OR3A4 通過抑制KLF6 促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移。另外有研究表明，KLF6在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)，并通過誘導(dǎo)NSCLC 細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長，這可能提示KLF6 是NSCLC 的抑癌因子［8］。本研究中，在NSCLC 細(xì)胞中過表達(dá)OR3A4 顯著降低KLF6 表達(dá)，而降低OR3A4 表達(dá)則明顯促進(jìn)KLF6 表達(dá)。另外結(jié)果證明NSCLC 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF6可以顯著減輕OR3A4 對NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。說明OR3A4 可能通過抑制KLF6 表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，OR3A4 至少部分地通過KLF6 沉默促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為OR3A4 在NSCLC 進(jìn)展中的作用提供了新的證據(jù)，并為NSCLC 的診斷和治療提供了一個(gè)潛在的標(biāo)志物。