閻巖 史承勇 朱志軍 丁雪燕

血管性疾病作為累及全身重要臟器的系統(tǒng)性病癥，最終可導(dǎo)致急性心肌梗死、腦卒中、晚期腎病等，具有較高的致死率。血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）主要是由膠原蛋白和彈力纖維蛋白等多種成分構(gòu)成的復(fù)雜動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)［1］。動(dòng)脈硬化度取決于血管ECM 中膠原蛋白與彈力纖維蛋白的比例。受年齡增加和高血壓等因素的影響，血管膠原/彈力纖維蛋白比例升高，ECM 硬度增加，血管壁彈力板退化，內(nèi)中膜增厚，導(dǎo)致動(dòng)脈壁硬化和管腔狹窄［2］。在此過程中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）感知其周圍ECM 硬度的增加，合成、增殖和遷移能力增強(qiáng)，引起內(nèi)膜和中膜重塑［3-4］。2018 年1 月至2019 年4 月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討細(xì)胞外基質(zhì)硬化對(duì)VSMC 遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)獲取及GSEA 富集分析 自NCBI 中的GEO 數(shù)據(jù)庫下載GSE100081 表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)。其中，樣本GSM2670937～GSM2670940（n=4）和GSM2670941～ GSM2670944（n=4）分別為病理硬度基質(zhì)和生理硬度基質(zhì)中培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）的RNA-seq 數(shù)據(jù)。采用GSEA3.0 版軟件，利用網(wǎng)站MsigDB 數(shù)據(jù)庫中c2.cp.reactome.v6.2.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集，按照默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1000 次，進(jìn)行富集分析。結(jié)果中P＜0.01，NES 絕對(duì)值＞1.0，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜20%的基因集判定為顯著富集。

1.2 人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMC）的培養(yǎng) HCASMC 及培養(yǎng)基均購自PromoCell 公司。細(xì)胞復(fù)蘇后，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用平滑肌細(xì)胞生長培養(yǎng)基（SMCGM2）培養(yǎng)。更換培養(yǎng)液1 次/2d，每3～4 天用0.25%胰酶消化傳代。取5～8 代、經(jīng)血清饑餓處理24h 的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別接種于彈性指數(shù)4KPa（Soft 組）和25KPa（Stiff 組）的6 孔彈性培養(yǎng)板（Softwell，Matrigen 公司），模擬生理和病理性細(xì)胞外基質(zhì)硬度對(duì)HCASMC 的影響。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 采用Trizol 法提取RNA。凝膠電泳檢測RNA 純度后， 按Primescript RT 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（TaKaRa 公司）步驟行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa 公司）說明書配制20μl反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3 復(fù)孔。 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列：PLCB2 上游引物：5'-ACCTTCCACAACTTCGTCTCC-3'， 下 游 引 物：5'-GGATGTTTGACTAGGGCCAGT-3'；GAPDH 上游引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.4 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 在6 孔板中加入1ml SDS 裂解液，充分裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA法測定收集到的上清液濃度，并據(jù)此配平各樣品，以保證每孔上樣30μg 蛋白。經(jīng)8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。在5%脫脂奶粉中室溫封閉1h 后，4℃下孵育一抗過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次后，室溫下孵育二抗1h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。使用Image J 軟件定量蛋白質(zhì)條帶。

1.5 干擾RNA 的合成和轉(zhuǎn)染 干擾RNA 的設(shè)計(jì)，合成及化學(xué)改性由吉瑪公司完成。采用lipofectamine 2000 試劑盒，分別將PLCB2 特異性干擾RNA（siPLCB2）和陰性對(duì)照干擾RNA（siScramble）轉(zhuǎn)入病理性外基質(zhì)硬度培養(yǎng)的HCASMC。轉(zhuǎn)染12h 后更換培養(yǎng)液，48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 平板劃線實(shí)驗(yàn) 取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用200μl 移液器槍頭在板底中央做出劃痕，無菌PBS 緩沖液洗板底3 次，去除劃掉的細(xì)胞殘?jiān)７謩e在劃痕后0h 和24h取樣拍照。以0h 的細(xì)胞劃痕寬度為基準(zhǔn)畫兩條直線，計(jì)數(shù)24h 時(shí)遷移至2 條直線間的細(xì)胞個(gè)數(shù)，作為遷移能力的定量指標(biāo)。

1.7 頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型 選取體重20～25g 的C57BL/6 雄性野生型小鼠，分為頸動(dòng)脈損傷+siPLCB2轉(zhuǎn)染組（n=10）和頸動(dòng)脈損傷+ siScramble 轉(zhuǎn)染組（n=10），對(duì)側(cè)血管作為正常對(duì)照。小鼠麻醉后，取頸部正中切口，暴露左頸總動(dòng)脈，用血管夾暫時(shí)阻斷血流，再將結(jié)扎線置于血管近心端備用。顯微剪剪開頸動(dòng)脈，插入0.38mm 金屬導(dǎo)絲，旋轉(zhuǎn)進(jìn)退摩擦血管壁，造成頸總動(dòng)脈損傷。退出導(dǎo)絲，結(jié)扎近心端。結(jié)扎后在損傷段血管周圍局部注射100μl 含有10μg siRNA的Pluronic 凝膠。將對(duì)側(cè)血管作為假手術(shù)組，除不進(jìn)行導(dǎo)絲損傷外，其余操作相同。術(shù)后14d 取出頸總動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定、切片后行HE 染色。利用計(jì)算機(jī)圖形分析系統(tǒng)檢測血管內(nèi)膜和中膜面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜（I/M）面積比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSEA 富集分析 GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的基因在Gβγ信號(hào)通路（P＜0.001，F(xiàn)DR=0.17）和PLC-β 介 導(dǎo)Gβγ信 號(hào) 通 路（P＜0.001，F(xiàn)DR=0.12）兩個(gè)基因集中顯著富集（見圖1A），其中PLCB2 的表達(dá)在病理硬度基質(zhì)培養(yǎng)的HCASMC 中顯著上調(diào)（logFC=2.78，P＜0.001）（見圖1B）。

圖1 GSEA富集分析

2.2 ECM 硬 化 上 調(diào)HCSMC 中PLCB2 表達(dá) 為進(jìn)一步明確ECM硬化對(duì)HCASMC 中PLCB2 表達(dá)變化的作用，分別在生理性ECM 硬度（Soft）和病理性ECM 硬度（Stiff）中培養(yǎng)HCSMC。qRT-PCR 結(jié)果提示Stiff 組中PLCB2 mRNA 的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.001，見圖2A），Western Blot 結(jié) 果 也 發(fā) 現(xiàn)Stiff 組中PLCB2 蛋白水平顯著高于Soft 組（P＜0.001，見圖2B）。

圖2 兩組HCSMC中PLCB2表達(dá)比較

圖3 兩組HCSMC的遷移能力比較

2.3 PLCB2 對(duì)硬化基質(zhì)中HCSMC 遷移的影響 應(yīng)用干擾RNA 敲低硬化基質(zhì)培養(yǎng)HCASMC 中PLCB2的表達(dá)（siPLCB2），與對(duì)照組（siScramble）比較，HCSMC 的遷移能力顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（62.33±4.32）VS（49.83±3.4），P=0.046］。見圖3。2.4 PLCB2 對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后新生內(nèi)膜的影響 構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型的同時(shí)抑制PLCB2 在損傷動(dòng)脈段的表達(dá)，14d 后觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜。siPLCB2 轉(zhuǎn)染組與同一時(shí)間的siScramble 組比較，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生受到明顯抑制，新生內(nèi)膜面積顯著減少［（siPLCB2 組新生內(nèi)膜面積：（4.43±0.64）×103μm2，I/M：（0.21±0.03）；siScramble 組 新 生 內(nèi)膜面積：（23.82±1.43）×103μm2，I/M：（1.18±0.06）］。見圖4。

圖4 兩組新生內(nèi)膜比較

3 討論

各種原因?qū)е碌难茏枞约膊【殡S著VSMC遷移、增殖異?；钴S和ECM 成分的過度沉積［5］。動(dòng)脈血管壁內(nèi)VSMC-ECM 的相互作用在維持血管壁穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ECM 硬度能夠影響干細(xì)胞的分化方向，不同ECM 硬度條件培養(yǎng)下的間充質(zhì)干細(xì)胞將會(huì)向神經(jīng)源性細(xì)胞、肌源性細(xì)胞和成骨細(xì)胞等不同的方向分化［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VSMC可感知?jiǎng)用}硬化病程中ECM 硬度的增加并響應(yīng)性出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為增殖、遷移能力增強(qiáng)，同時(shí)合成分泌功能活躍，進(jìn)一步促進(jìn)血管ECM 重塑［7］。

本研究通過分析病理和生理性ECM 硬度條件下培養(yǎng)的HCASMC 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因在Gβγ信號(hào)通路和PLC-β 介導(dǎo)的Gβγ信號(hào)通路兩個(gè)基因集中顯著富集，且兩個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子PLCB2 表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，病理性ECM 硬度能夠明顯上調(diào)HCASMC 中PLCB2 的蛋白水平。PLC-β 是磷脂酶C 的β 型同工酶，存在PLCB1～4 共4 種分子亞型。有研究報(bào)道PLCB1 和PLCB3 亞型廣泛存在于多種細(xì)胞類型中，而PLCB2 僅在機(jī)械力敏感的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［8］，提示其在細(xì)胞響應(yīng)周圍環(huán)境機(jī)械力學(xué)信號(hào)方面發(fā)揮重要作用。作者采用彈性指數(shù)25Kpa 的特制培養(yǎng)板刺激HCASMC，模擬血管硬化狀態(tài)下病理性ECM 硬度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLCB2 mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)，表明HCASMC 在感知周圍異常增高的ECM 硬度后反應(yīng)性的上調(diào)PLCB2 表達(dá)，提示其在VSMC 響應(yīng)ECM 硬化過程中起關(guān)鍵作用。

本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低PLCB2 表達(dá)能夠明顯抑制病理性ECM 硬度對(duì)HCASMC 的促遷移作用。既往研究顯示，頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷能夠引起血管ECM 硬化、新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄［9］。因此，為進(jìn)一步明確PLCB2 對(duì)VSMC 遷移的影響，構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷模型并通過外膜轉(zhuǎn)染PLCB2 特異性干擾RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siPLCB2 可明顯抑制損傷后新生內(nèi)膜的形成。作為PLC-β 的重要亞型，PLCB2 通過水解磷脂酰肌醇4，5 二磷酸（PIP2），產(chǎn)生第二信使分子二乙酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。IP3 可進(jìn)一步作用于胞內(nèi)敏感的Ca2+儲(chǔ)存庫，使胞內(nèi)Ca2+濃度增加，而DAG 又可激活蛋白激酶C。因此，PLCB2 的表達(dá)上調(diào)可通過多種途徑發(fā)揮生理效應(yīng)，而其參與ECM硬化條件下VSMC 過度遷移的具體機(jī)制有待今后深入研究。

綜上所述，病理性ECM 硬度可上調(diào)VSMC 中PLCB2 的表達(dá)，干擾抑制PLCB2 能夠有效抑制VSMC的過度遷移，減輕新生內(nèi)膜的形成。該研究結(jié)果加深了對(duì)血管基質(zhì)硬化調(diào)控VSMC 功能的了解，為動(dòng)脈硬化的診斷和治療提供新的潛在靶點(diǎn)。