趙瑋 姜文兵 朱寧 趙旭勇 吳悠揚
急性心肌梗死(AMI)是指冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死,常并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭,可危及患者生命。目前隨著冠狀動脈介入技術以及器械的快速發(fā)展,經皮冠狀動脈介入治療(PCI)已成為ST 段抬高的心肌梗死的標準療法。伴隨支架的大量應用,支架內再狹窄而導致冠脈再次堵塞的事件也隨之頻現(xiàn),雖然支架已經從傳統(tǒng)的裸金屬支架發(fā)展至現(xiàn)在的藥物支架,但是晚期支架內再狹窄的發(fā)生仍是不可忽視的問題。目前臨床研究顯示[1],生物可降解支架的出現(xiàn)可能解決支架植入術后再狹窄這一問題,但是基于目前的臨床研究療效仍然不確切,還需進一步改進支架或者尋找其它有效藥物治療。支架植入術后再狹窄的發(fā)生主要是由于支架對冠脈的損傷刺激平滑肌細胞增殖、遷移的增加,最終導致血管堵塞,因此促進平滑肌細胞的凋亡有助于減少支架內再狹窄的發(fā)生。以往研究表明[2]百里醌能抑制細胞增殖從而對大鼠缺血再灌注損傷起到保護作用,所以本研究旨在觀察百里醌能否抑制平滑肌細胞的增殖、遷移以及其作用的機制,為臨床應用于減少PCI 術后支架內再狹窄奠定實驗基礎。
1.1 主要材料和試劑 SPF 級SD 雄性大鼠購自武漢醫(yī)科大學動物中心,百里醌購自上海恒斐生物科技有限公司(廠家:Solarbio)DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司),TRAM-34、胰蛋白酶、MTT(Sigma 公司),兔抗鼠平滑肌α-actin(α-SM A)抗體、S-ABC 過氧化物酶試劑盒、DAB 顯色試劑盒(上海西唐生物科技有限公司),TRIzol(Invitrogen 公司),Western blot檢測試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。
1.2 方法 (1)頸動脈平滑肌細胞分離及培養(yǎng):選取250~300g SD 雄性大鼠,腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉,麻醉顯效后用手術刀切開頸部皮膚,分離出頸動脈放入生理鹽水里漂洗凈血管。用剪刀剪開血管,鑷子小心刮去上層的內皮細胞。在20%FBS 的DMEM中用剪刀剪碎平滑肌細胞層,靜置培養(yǎng)3~4d 后可見平滑肌細胞爬出,用PBS 洗3 次后繼續(xù)培養(yǎng),直到細胞長滿培養(yǎng)皿開始傳代,傳代3~8 代后細胞可用于實驗。(2)實驗分組及干預措施:分離培養(yǎng)頸動脈平滑肌細胞分為空白對照組、低劑量百里醌組(1mg/L)、中劑量百里醌組(10mg/L)和高劑量百里醌組(100mg/L),除對照組外,百里醌各劑量組細胞分別以上述不同濃度的百里醌組進行干預。(3)劃痕實驗觀察平滑肌細胞遷移情況:取4~7 代頸動脈平滑肌細胞置于0.5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后,用200μl 槍頭在中間劃出一條直線,即在線內無細胞存在,40ng/ml 血小板衍生長因子(PDGF)刺激細胞24h,倒置顯微鏡下觀察載劃痕處細胞的遷移情況。(4)MTT 法檢測平滑肌細細胞增殖活性:取4~7 代頸動脈平滑肌細胞0.5%FBS 的DMEM 培養(yǎng)24h 后,40ng/ml 血小板衍生長因子(PDGF)刺激細胞24h,MTT 試劑盒檢測各時間點細胞增殖情況。(5)細胞增殖及凋亡檢測:利用以下染色方法對細胞增殖、凋亡進行評估:①利用α-SMA和PCNA 免疫組織化學染色檢測頸動脈平滑肌細胞增殖情況;②TUNEL 染色檢測頸動脈平滑肌細胞的凋亡情況,即顯微鏡下計數(shù)每個視野中凋亡細胞數(shù)(陽性細胞數(shù))和細胞總數(shù),計算細胞凋亡率[凋亡率=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%]。(6)Western blot 檢測:用各干預因素干預平滑肌細胞48h 后,按照說明書裂解細胞,提取總蛋白后電泳、轉膜、封閉、再孵育,western blot 檢 測PTEN、P-AKT、AKT、Bax 和Bcl-2蛋白的表達量。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行分析,數(shù)據(jù)均以()表示,兩組間的比較采用t 檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 百里醌對平滑肌細胞遷移面積的影響 空白對照組遷移面積為(0.89±0.05)%,低劑量百里醌組遷移面積為(0.67±0.03)%,中劑量百里醌組遷移面積為(0.45±0.03)%,高劑量百里醌組遷移面積為(0.31±0.02)%。與空白對照組比較,百里醌各劑量組遷移面積明顯減小,遷移面積的縮小呈劑量依賴性變化,即百里醌劑量越大,遷移面積越小,各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.2 百里醌對平滑肌細胞增殖的影響 MTT 檢測結果顯示(見圖1),百里醌各組加入不同濃度的百里醌后,與空白對照組比較,百里醌各劑量組OD 值明顯降低;百里醌各劑量組比較,其OD 值呈劑量依賴性趨勢改變,即劑量越大OD 值越小,三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對各組細胞進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)(見圖2、3),與空白對照組比較,百里醌各劑量組α-SMA 和PCNA 表達陽性率明顯降低,百里醌各劑量組α-SMA 和PCNA 表達陽性率也呈劑量依賴性趨勢改變,即劑量越大α-SMA 和PCNA 表達陽性率越小,三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。以上實驗結果均表明,百里醌能抑制平滑肌細胞增殖,且劑量越大作用越明顯。
圖1 各組細胞不同時間點增殖活性比較
圖2 各組α-SMA免疫組織化學染色
表1 各組α-SMA和PCNA免疫組織化學染色檢測細胞陽性率比較[%,()]
表1 各組α-SMA和PCNA免疫組織化學染色檢測細胞陽性率比較[%,()]
注:與空白對照組比較,*P<0.05;與低劑量百里醌組比較,#P<0.05;與中劑量百里醌組比較,△P<0.05
組別 α-SMA細胞陽性率 PCNA細胞陽性率低劑量百里醌組 55.64±2.58* 47.42±1.15*中劑量百里醌組 42.98±2.75*# 33.32±1.12*#高劑量百里醌組 30.49±1.12*#△ 19.81±1.36*#△空白對照組 61.50±1.22 53.08±0.54
2.3 百里醌對平滑肌細胞凋亡的影響 對各組細胞TUNEL 染色(見圖4),與空白對照組比較,低劑量百里醌組和中劑量百里醌組細胞凋亡率無明顯差異(P>0.05),而高劑量百里醌細胞凋亡率升高,與其他組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。
圖3 各組PCNA免疫組織化學染色
圖4 各組細胞TUNEL染色
表2 各組細胞凋亡率比較[%,()]
表2 各組細胞凋亡率比較[%,()]
注:與其它組比較,*P<0.05
組別 細胞凋亡低劑量百里醌組 10.14±1.55中劑量百里醌組 9.85±3.97高劑量百里醌組 24.13±3.55*空白對照組 10.16±1.94
2.4 百里醌對平滑肌細胞蛋白表達的影響 Western blot 檢測結果顯示,百里醌各劑量組的PTEN 和Bax的表達量顯著高于對照組,而P-AKT、AKT 和bcl-2蛋白的表達量顯著低于對照組;百里醌各劑量組之間比較,PTEN 和Bax 蛋白的表達量隨著劑量增大而升高,P-AKT、AKT 和Bcl-2 蛋白的表達量隨著劑量增大而降低,各組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖5)。
圖5 各組PTEN、P-AKT、AKT、Bax和bcl-2蛋白表達量比較(注:與空白對照組比較,*P<0.05;與低劑量百里醌組比較,#P<0.05;與中劑量百里醌組比較,△P<0.05)
成熟動物的血管平滑肌細胞(SMCs)是高分化和高特異性的細胞,其主要功能是通過調節(jié)血管張力和直徑來調控血管的收縮和舒張,進而控制血壓和血流的分布。通常情況下在成熟血管中平滑肌細胞極少處于增殖狀態(tài)以及表現(xiàn)出分泌活性[3],但是在應對血管損傷、炎癥、血流剪切力增加的時候,平滑肌細胞受到各種生長因子比如血小板源性生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等的刺激而處于活躍的增殖和遷移狀態(tài),最終促進血管重構,導致管腔狹窄[4],進一步引發(fā)血管相關的疾病,如支架術后再狹窄。
百里醌是黑種草黑籽精油的主要活性成分,主要具有抗炎和抗癌作用。此外研究發(fā)現(xiàn)百里醌具有鎮(zhèn)痛、抗糖尿病、抗組胺作用,能夠緩解呼吸系統(tǒng)疾病、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化和高血壓等藥理作用[5]。最重要的是百里醌的抗癌活性在多種動物模型和腫瘤細胞株被證明是有效的[6-7]。百里醌能抑制轉錄激活因子3(STAT3)的激活,導致人類多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡[8]。在多發(fā)性骨髓瘤、鱗狀細胞癌、人類前列腺癌細胞株中百里醌的抗增殖效應主要與抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)有關。另外有研究顯示,百里醌能通過增加Bax/Bcl-2 比值促進細胞凋亡和減少腫瘤增生[9],同時百里醌也能通過上調PTEN 從而抑制下游AKT 的磷酸化來抑制腫瘤細胞的增殖[10]。PTEN位于人類染色體10q23.3,其具有調節(jié)細胞生長、凋亡的作用,并與細胞外基質的蛋白相互作用,抑制細胞的遷移、擴散和粘附?;谄湓诙喾N腫瘤中的高頻率突變,PTEN 被認為是一種腫瘤抑制基因。隨后有研究表明PTEN 同時具有蛋白質酪氨酸磷酸酶和三磷酸肌醇磷酸酶活性。PTEN 主要通過抑制PI3K/AKT 通路介導細胞的凋亡[11]。
以往研究表明PTEN 的上調能抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[12],AKT1 能通過FoxO3a 和APAF1促進血管平滑肌細胞凋亡從而減緩動脈重構與動脈粥樣硬化。作者在細胞凋亡檢測中發(fā)現(xiàn),高劑量百里醌可使平滑肌細胞大量凋亡。細胞遷移和增殖影響檢測中,均顯示隨著百里醌劑量的加大,其抑制平滑肌細胞遷移和增殖作用越明顯。同時劑量的增加對PTEN/AKT 信號通路相關蛋白的影響越大,高劑量百里醌上調PTEN 蛋白和下調P-AKT 蛋白、AKT 蛋白表達。通過檢測Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白發(fā)現(xiàn),Bax 蛋白隨劑量增大表達水平上升,Bcl-2 蛋白表達水平下降。通過以上一系列結果,作者推測,百里醌可上調PTEN 蛋白和Bax 蛋白的表達,下調P-AKT 蛋白、AKT 蛋白和Bcl-2 蛋白的表達,通過抑制PI3K/AKT 通路活化和提高Bax/Bcl-2 比值,進一步抑制細胞增殖、遷移和介導細胞的凋亡。
綜上所述,百里醌能夠抑制平滑肌細胞增殖和遷移,其作用機制與PTEN/AKT 信號通路活化相關。然而本研究仍有不足之處,百里醌是由不同成分組成的中藥提取物,想要了解哪些活性成分具有抑制平滑肌細胞增殖和遷移作用,仍需進一步研究。