張玉霞，楊金興，孟 凱，蔡李萌，袁小遠(yuǎn)*，王友令*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南250100；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109)

2017 年，我國(guó)暴發(fā)了一種主要引起雛鵝痛風(fēng)癥狀的傳染病。該病可導(dǎo)致5 日齡～20 日齡雛鵝發(fā)生腹瀉、跛行或癱瘓，剖檢可見(jiàn)內(nèi)臟器官和關(guān)節(jié)有大量的尿酸鹽沉積，給我國(guó)的養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。多位學(xué)者研究初步證實(shí)鵝星狀病毒(Astrovirus，AstV)是該次疫病的主要病原體[1-2]。鵝AstV屬于星狀病毒科星狀病毒屬，基因組分析顯示：該次分離的病毒株與已發(fā)表的火雞和鴨感染的AstV株明顯不同，屬于新的基因型[3-4]。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)該病毒的方法主要有RT-PCR 和熒光定量PCR 方法，這些檢測(cè)方法需借助昂貴的儀器、成本較高，不適用于基層應(yīng)用[5-6]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，其反應(yīng)過(guò)程始終維持在恒定的溫度下進(jìn)行。和其它傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如病毒分離鑒定、ELISA、PCR等相比，具有操作簡(jiǎn)便、高效快速、不需要昂貴儀器的特點(diǎn)，已廣泛用于多種動(dòng)植物的病原微生物檢測(cè)中[7-8]。本研究針對(duì)鵝AstV 的ORF1b 基因序列，設(shè)計(jì)特異性LAMP 引物，建立了該病毒的快速特異LAMP 檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 鵝AstV SD17 株、鵝細(xì)小病毒GPV-E 株、鵝副黏病毒YG 株和鴨坦布蘇病毒HB株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF 雞研究中心分離和鑒定；鵝源H9N2 亞型禽流感病毒S2 株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

38 份疑似樣品于2017 年～2018 年采自山東、江蘇、安徽、河南等不同地區(qū)養(yǎng)鵝場(chǎng)。發(fā)病鵝均臨床具有痛風(fēng)癥狀，其中5 份為腎臟組織，其它均為肝臟組織。所有樣品置于-80 ℃保存。

病毒DNA/RNA 提取試劑盒、RT 試劑盒及一步法RT-PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；LAMP 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；TE 可視染料購(gòu)自天津捷易特生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 登錄的多株鵝源 AstV 株 ORF1b 序列，在線 website: http://primerexplorer.jp/e/ 設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因的LAMP 引物，包括內(nèi)引物FIP/BIP、外引物F3/B3 和環(huán)引物L(fēng)B/LF(表1)。同 時(shí) 利 用 Primer premier 5.0 軟 件 設(shè) 計(jì)RT-PCR 擴(kuò)增引物PCR-F/PCR-R，預(yù)期擴(kuò)增400 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 LAMP 和PCR 擴(kuò)增引物Table 1 The primers used for LAMP and PCR

1.3 LAMP 反應(yīng)的優(yōu)化與建立 利用RNA 提取試劑盒提取AstV SD17 株RNA，按照RT 試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用Nano Drop ND1000 檢測(cè)其濃度后進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)。LAMP 反應(yīng)體系 25 μL 如下：2×buffer 12.5 μL、1.0 μL 酶混合物(EM)、FIP和 BIP 各 40 pmoL、F3 和 B3 各 10 pmoL、LB 和 LF各20 pmoL，cDNA 2 μL，余下為超純水。設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照。為摸索LAMP 最佳反應(yīng)溫度，根據(jù)引物TM 值，共設(shè)置了8 個(gè)溫度梯度：60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃、66 ℃、67 ℃。反應(yīng)時(shí)間設(shè)置30 min、40 min、50 min、60 min、90 min時(shí)間段。反應(yīng)后基于TE 指示劑顏色的改變判斷結(jié)果確定LAMP 的最佳反應(yīng)條件，陽(yáng)性時(shí)為亮藍(lán)色，陰性時(shí)為無(wú)色。

1.4 特異性試驗(yàn) 采用病毒DNA/RNA 提取試劑盒提取鵝細(xì)小病毒的DNA 以及鵝AstV SD17 株、鵝副黏病毒、鴨坦布蘇病毒和鵝H9N2 亞型禽流感病毒的RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后作為模板，采用上述優(yōu)化的LAMP 方法進(jìn)行特異性檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.5 敏感性試驗(yàn) 將反轉(zhuǎn)錄得到的AstV cDNA (原液濃度為100 ng/μL) 10 倍倍比稀釋，共設(shè)置6 個(gè)稀釋梯度(包括原液在內(nèi))，濃度依次為100 ng/μL～1 pg/μL，分別以各稀釋度cDNA 為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的敏感性。

1.6 臨床樣本檢測(cè) 將來(lái)自不同養(yǎng)殖區(qū)域的38 份疑似發(fā)病鵝肝臟、腎臟病料樣品剪碎后，按1∶3 體積加入無(wú)菌PBS，反復(fù)凍融3 次后，3 000 r/min 離心10 min，取上清備用。按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后以所得cDNA 為模板，按照建立的LAMP 進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)所有樣品進(jìn)行一步法RT-PCR 檢測(cè)，25 μL 的反應(yīng)體系包括：12.5 μL 2×buffer，PCR-F 和 PCR-R 各 20 pmoL、混合酶 1 μL、RNA 5 μL，余下為 ddH2O。反應(yīng)過(guò)程為 RT：42 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；隨后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 94 ℃ 20 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃4 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP 反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果 在LAMP 反應(yīng)體系中，對(duì)最佳溫度和作用時(shí)間進(jìn)行篩選，確定最佳反應(yīng)溫度為64 ℃、最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.2 LAMP 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用建立的LAMP 方法分別檢測(cè)AstV SD17、鵝細(xì)小病毒、鵝副黏病毒、鵝H9N2 亞型禽流感病毒和鴨坦布蘇病毒，結(jié)果顯示：僅AstV 樣品顯示為亮藍(lán)色，判定為陽(yáng)性，其它樣品顏色未見(jiàn)變化，均判為陰性(圖1)。表明建立的LAMP 方法能夠特異性地檢測(cè)鵝AstV。

圖1 LAMP 方法特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Specificity test of LAMP reaction

2.3 LAMP 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果 將10 倍梯度稀釋(包括原液在內(nèi)，共6 個(gè)稀釋度)的AstV cDNA 模板分別進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。結(jié)果顯示，建立的LAMP 方法能夠檢測(cè)至樣本的102稀釋度，即1 ng/μL 的cDNA(圖2)。表明該方法的敏感性較高。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)臨床采集到的38 份疑似AstV 樣品，同時(shí)應(yīng)用本研究建立的LAMP 和RT-PCR 方法檢測(cè)(部分樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示：對(duì)5 份腎臟病料樣品，2 種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率一致，均為3/5；對(duì)33 份肝臟樣品，LAMP 方法檢出20 份陽(yáng)性樣品，比RT-PCR 多檢出1 份(表2)，通過(guò)測(cè)序證實(shí)這份LAMP 檢測(cè)陽(yáng)性樣品為AstV。兩種方法的陽(yáng)性符合率為95.65 %。綜上表明，本研究建立的LAMP 檢測(cè)方法更適用于臨床Astv 的檢測(cè)。

圖2 LAMP 反應(yīng)靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Sensitivity test of LAMP reaction

表2 臨床樣品 LAMP 與RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Table 2 Comparative evalution of LAMP assay with RT-PCR for clinical smples

圖3 部分臨床樣品RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of RT-PCR assay of some clinical samples

3 討 論

已有研究表明AstV 不僅在我國(guó)水禽群體中分布地區(qū)十分廣泛，在環(huán)境中大量存在，而且具有寬廣的宿主范圍[9]，能夠引起雞和火雞的腸炎、雞的腎炎、鴨的病毒性肝炎等，目前無(wú)可用的商業(yè)化疫苗防疫，導(dǎo)致AstV 難以控制和短期根除。本次疫情中患病雛鵝死淘率高達(dá)40 %以上，幸存下來(lái)的病鵝預(yù)后也較差，對(duì)疫區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)對(duì)該病原引起足夠的重視。因此尋找一種行之有效，簡(jiǎn)便、實(shí)用的檢測(cè)方法對(duì)于該疫病的診斷和防治研究具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外對(duì)禽病常用的診斷技術(shù)診斷包括幾個(gè)方面：臨床診斷、病原檢測(cè)、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等。由于目前禽病發(fā)病癥狀及剖檢病變不典型性，僅根據(jù)臨床癥狀已很難做到確診；病原檢測(cè)主要通過(guò)分離獲得致病性病原證明病原存在，該方法確實(shí)可靠，是經(jīng)典的確診方法，但一般所需時(shí)間長(zhǎng)、成本高，不利于疫情控制；血清學(xué)診斷方法主要根據(jù)高特異性的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行判斷，對(duì)于新發(fā)病確診難度較大；分子生物學(xué)是近年來(lái)常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，主要通過(guò)檢測(cè)病毒核酸存在證明病毒感染，包括PCR/RT-PCR、熒光定量PCR/ 熒光定量RT-PCR、LAMP、基因芯片等。本研究所用的LAMP 檢測(cè)方法，是日本學(xué)者Notmomi 等最先公開(kāi)報(bào)道的一種用于基因檢測(cè)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[10]，與其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法相比，具有快速、敏感、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。本研究根據(jù)GenBank 中鵝AstV ORF1b 基因保守區(qū)域的6 個(gè)特異性部位設(shè)計(jì)引物，以經(jīng)RT-PCR 和電鏡雙重鑒定的AstV SD17 株為陽(yáng)性對(duì)照，利用聚合酶混合物在恒溫64 ℃條件下反應(yīng)60 min 即可完成擴(kuò)增，在反應(yīng)管內(nèi)加入TE染料根據(jù)顏色變化直接判定結(jié)果，省去了RT-PCR方法的繁瑣步驟和對(duì)貴重儀器的依賴。經(jīng)檢測(cè)該方法特異性強(qiáng)、敏感性與RT-PCR 方法相當(dāng)。臨床樣品檢測(cè)顯示，建立的LAMP 方法與傳統(tǒng)的RT-PCR方法有較高的符合率，這與其他學(xué)者報(bào)道的LAMP方法用于檢測(cè)禽流感、新城疫等[11-12]病毒結(jié)果相符。

綜上，本研究根據(jù)AstV 的保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了AstV 的LAMP 檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、特異、高效，適用于基層檢測(cè)部門與檢疫機(jī)構(gòu)。