賀芝蘭 謝文瑞 何君連 晏杰 陳墾 馮致婷

1廣東藥科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510310）；廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2消化內(nèi)科，4病理科（廣州510030）；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院過敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510030）

大腸息肉為臨床常見病，大腸息肉的發(fā)病率逐年上升，據(jù)報(bào)道美國3 196 名50 ～75 歲退伍軍人中患有腸道息肉者占53.8%，腺瘤息肉者34.8%［1］，越來越多的證據(jù)表明鋸齒狀息肉、腺瘤息肉會(huì)導(dǎo)致腸癌（colorectal cancers，CRCs）［2］。人們對(duì)腸息肉-腺瘤性息肉-腸癌的演變過程逐步了解，更注重腸息肉的早期發(fā)現(xiàn)、早切除治療及定期復(fù)查，腸鏡檢查是大腸息肉診治的首選，但存在一定風(fēng)險(xiǎn)［3］以及對(duì)腺瘤性息肉62%的誤診率［4］，且世人對(duì)腸鏡的接受度有待提高。為避免患者腸鏡檢查前的腸道準(zhǔn)備及畏懼心理，應(yīng)開發(fā)一些腺瘤性息肉篩查的生物標(biāo)記物，通過更簡單易行的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)發(fā)現(xiàn)大腸腺瘤性息肉、預(yù)防癌變具有重大意義。目前已證實(shí)IL-18 在炎癥性腸?。?］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［6］、結(jié)腸癌［7］、胃癌［8］等患者體內(nèi)表達(dá)均顯著上調(diào)，且炎癥小體3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）有關(guān)的炎癥通路也被激活［10］。有研究顯示IL-18對(duì)凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1 ）、白介素1β（Interlekin1β，IL-1β）等在NLRP3 等炎癥小體形成過程具重要調(diào)節(jié)作用，炎癥小體生成過多會(huì)促進(jìn)腫瘤生長［4，9-10］。因此，筆者通過在腺瘤性息肉患者體內(nèi)檢測(cè)出IL-18 以及炎癥小體形成通路相關(guān)的炎癥因子，以提示腺瘤息肉復(fù)發(fā)以及它可能轉(zhuǎn)變成腸道腫瘤。對(duì)比對(duì)照組、非腺瘤息肉組和腺瘤性息肉組的血清和腸道息肉組織標(biāo)本中IL-18、炎癥小體的表達(dá)情況，分析二者和腺瘤性息肉以及息肉癌變發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，不僅對(duì)腺瘤息肉患病情況的監(jiān)測(cè)，還對(duì)腸道腫瘤病情發(fā)展過程早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)有重要臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 參考文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)及診斷結(jié)果［11-12］選取我院2017年9月至2018年5月診斷的大腸息肉患者20 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80 歲住院患者，男女不限；（2）腸道存在息肉樣病變并同意病理活檢；（3）患者和家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腸道準(zhǔn)備欠佳者；（2）嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；（3）有結(jié)直腸腫瘤病史、家族性腺瘤性息肉病和炎癥性腸病病史；（4）鋸齒狀腺瘤者；（5）有進(jìn)展期結(jié)直腸腫瘤表現(xiàn)者；（6）拒絕簽署相關(guān)知情同意書者。依息肉性質(zhì)分2 組：非腺瘤性息肉組B 組（包括炎性息肉、增生性息肉等），男7 例，女3 例，年齡（47 ～79）歲，平均年齡（63.5 ± 10.6）歲，病程5 d～5年，單發(fā)腸息肉9例，多發(fā)息肉者1 例；腺瘤性息肉組C 組（包括管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、混合性腺瘤），男6 例，女4例，年齡（56 ～79）歲，平均年齡（66.5 ± 7.0）歲，病程30 d～3年，單發(fā)腸息肉1 例，多發(fā)腸息肉9 例；另有對(duì)照組10 例（A 組），對(duì)照組為健康體檢志愿者，收集入組人員血清和息肉標(biāo)本或正常腸黏膜組織標(biāo)本。本研究取得了患者的知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。收集入組人員的一般資料和臨床癥狀，B 組和C 組患者的性別、年齡、臨床癥狀及病理類型具有可比性。

1.2 主要器械和材料 電子纖維結(jié)腸鏡PCFQ260AZI（Olympus 公司），一次性活檢鉗2422BT（Wilson公司），Western Blot儀器PowerPac Basic（Bio-Rad 公司），ELISA 儀器Varioskan Flash（THERMO公司）。WB 抗體：一抗：兔抗人的NLRP3（D4D8T，CST，1∶1 000），兔抗鼠的ASC（#67824，CST，1∶1 000），兔抗人的Caspase-1（06-503-I，Millipore，1∶4 000），鼠抗人的甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（RM2002，北京銳抗，1∶1 000）；二抗：山羊抗鼠（RM3001，北京銳抗，1∶1 000），山羊抗兔（RM3002，北京銳抗，1∶1 000）。IHC 抗體：兔抗人的IL-18（b68435，abcam，1∶900），鼠抗人的Ki-67（ZM-0166，中杉金橋，1∶100）。ELISA 試劑盒：人的IL-18（CSB-E07450h，CUSABIO），人的IL-1β（437004，Bio-Legend）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清IL-18、IL-1β 含量檢測(cè) 入組患者均清晨空腹采靜脈血3 ～5 mL，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，離心10 min 后取1mL 血清儲(chǔ)藏于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，依?jù)IL-18 和IL-1β Elisa 試劑盒方法操作檢測(cè)患者血清IL-18、IL-1β 表達(dá)水平，所有標(biāo)本測(cè)兩次取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 結(jié)腸鏡檢查 患者常規(guī)服用聚乙二醇清潔腸道后使用奧林巴斯PCF-Q260AZI 行腸鏡檢查，并插至回腸末端，記錄息肉部位、大小、形態(tài)并采圖，采用活檢鉗鉗取息肉組織或正常腸黏膜組織，一部分直接用多聚甲醛固定做病理切片，另一部分馬上儲(chǔ)存于液氮罐中備用。

1.3.3 病理蘇木素-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色） 患者腸息肉或正常腸粘膜組織標(biāo)本離體后，立即用4%多聚甲醛固定24 小時(shí)后包埋并切取組織白片，一部分按照HE 染色方法染色后封片，閱片、觀察并比較三組患者息肉組織鏡下特點(diǎn)。

1.3.4 免疫組化（immunohistochemical，IHC）染色 患者腸息肉或正常腸粘膜組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)切取白片后，根據(jù)Ki-67、IL-18 抗體說明書，并按照脫蠟-水化-氧化-修復(fù)-敷一抗二抗-染色-封片的常規(guī)免疫組化染色步驟，閱片并比對(duì)三組患者息肉組織中的Ki-67、IL-18 的表達(dá)量。

1.3.5 蛋白印跡（western blot，WB）實(shí)驗(yàn) 取各組患者大腸息肉組織按照NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1 和GAPDH 等抗體說明書，根據(jù)裂解組織-配膠-煮樣-電泳-轉(zhuǎn)膜-敷一抗二抗-曝光的常規(guī)Western blot實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)在各組患者腸息肉組織中炎癥通道相關(guān)的蛋白或炎癥因子的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用率表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（）表示，組間比較運(yùn)用重復(fù)測(cè)量多因素方差分析，配對(duì)資料t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非腺瘤息肉組、腺瘤性息肉組兩組患者的臨床表現(xiàn)比較 兩組患者的臨床表現(xiàn)主要有腹痛腹脹、黑便或便血、大便習(xí)慣及性狀改變等癥狀，其中以腹痛腹脹、大便習(xí)慣改變?yōu)橹鳎瑑山M差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.903，見表1），根據(jù)一般資料的內(nèi)容對(duì)兩組患者的性別、年齡、病程等基本信息進(jìn)行比較，顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 B、C 組患者臨床表現(xiàn)Tab.1 The clinical manifestations of group B and group C例（%）

2.2 血清中IL-18、IL-1β 表達(dá)量在三組之間的比較 腺瘤性息肉組患者血清IL-18 含量顯著升高，對(duì)照組與非腺瘤息肉組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.999），對(duì)照組與腺瘤性息肉組、非腺瘤息肉組與腺瘤性息肉組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0008、0.0036），而IL-1β 的表達(dá)在三組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組患者血清中的IL-18、IL-1β表達(dá)量Tab.2 The expression levels of IL-18 and IL-1β in serum of three groups of patients±s，pg/mL

表2 各組患者血清中的IL-18、IL-1β表達(dá)量Tab.2 The expression levels of IL-18 and IL-1β in serum of three groups of patients±s，pg/mL

注：A 組，對(duì)照組；B 組，非腺瘤息肉組；C 組，腺瘤性息肉組（單位：pg/mL，α=0.05，P ＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）

組別P 值抗體IL-18 IL-1β A 組130.67±82.43 0.33±0.05 B 組132.67±107.71 0.32±0.07 C 組506.77±287.20 0.33±0.06 A 組vs.B 組0.9999 0.8447 A 組vs.C 組0.0008 0.6893 B 組vs.C 組0.0036 0.2640

2.3 腸鏡結(jié)果和病理結(jié)果比較 腸鏡下表現(xiàn)：對(duì)照組腸粘膜光滑，血管紋理清晰，非腺瘤息肉組可見丘狀黏膜隆起，隆起處未見血管擴(kuò)張，腺瘤性息肉組息肉表現(xiàn)為有蒂或無蒂，但形態(tài)不規(guī)則且息肉表面腺管明顯錯(cuò)亂。病理結(jié)果顯示，對(duì)照組腸黏膜，HE 染色顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)和極性均正常，未見炎性細(xì)胞浸潤；非腺瘤息肉組的炎性增生性息肉HE 染色可見細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核變長但小于細(xì)胞的1/3，腺腔正常；腺瘤性息肉HE 染色見胞核明顯變長大于細(xì)胞直徑1/3，腺腔明顯延長。見圖1。

圖1 結(jié)腸鏡檢查時(shí)白光內(nèi)鏡下圖像及其HE 染色（HE×40）Fig.1 The white light endoscopic image during colonoscopy and it′s HE staining images（HE×40）

2.4 Ki-67、IL-18 的免疫組化染色試驗(yàn) 對(duì)患者的腸息肉組織切片進(jìn)行IL-18 的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)腺瘤組的息肉組織中的IL-18 陽性表達(dá)明顯高于炎性增生息肉組、對(duì)照組。另外，對(duì)腸息肉組織切片進(jìn)行Ki-67 染色，進(jìn)行細(xì)胞增殖指數(shù)的比對(duì)，根據(jù)三組結(jié)果顯示腺瘤息肉的惡性程度明顯高于對(duì)照組和非腺瘤息肉組。見圖2。

圖2 腸息肉組織的免疫組化染色（Ki-67、IL-18）（IHE×40）Fig.2 The immunohistochemical staining of intestinal polyps（Ki-67、IL-18）（IHE×40）

2.5 炎癥小體在息肉或腸道黏膜中表達(dá)量比較WB結(jié)果顯示腸息肉轉(zhuǎn)變成腺瘤息肉過程中IL-1β、NLRP3、ASC、Caspase-1、Active-caspase-1（P20）（Active-caspase-1 是Caspase-1 活化后自我催化剪切后的二聚體，包括P20、P10 兩個(gè)片段）在對(duì)照組、非腺瘤組、腺瘤息肉組患者腸息肉組織中均有表達(dá)，而IL-1β、NLRP3、Active-caspase-1（P20）在腺瘤性息肉組中表達(dá)明顯增強(qiáng)，而Caspase-1 在腺瘤性息肉中表達(dá)明顯下調(diào)，并對(duì)WB 結(jié)果進(jìn)行相關(guān)蛋白的灰度分析，提示腺瘤性息肉組與非腺瘤性息肉中IL-1β（P= 0.0091）、NLRP3（P= 0.0080）、Active-caspase-1（P20）（P= 0.0435）、Caspase-1（P=0.0137）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 患者腸息肉組織裂解液的Western Blot 實(shí)驗(yàn)及其灰度分析（NLRP3，Caspase-1，IL-1β，ASC）Fig.3 WB analysis of intestinal polyp tissue lysate in patients and it′s gray-scale analysis（NLRP3，Caspase-1，IL-1β，ASC）

3 討論

腸息肉包括腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉，前者包括管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、混合型（管狀-絨毛狀）腺瘤，后者包括增生性息肉、炎性息肉、幼年性息肉。有研究表明息肉患者中腺瘤性息肉的發(fā)生率已達(dá)32%［13］。本研究顯示非腺瘤性息肉和腺瘤性息肉的發(fā)病率與患者的年齡、性別、臨床表現(xiàn)幾項(xiàng)基本信息無明顯相關(guān)性，不排除樣本量較小的問題，故會(huì)加大樣本量再進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)。結(jié)腸癌占全球癌癥相關(guān)病死率的10%，在我國腸癌的5年生存率僅60%［14］。由于部分人排斥腸鏡檢查，已開發(fā)出糞便血紅蛋白檢測(cè)試驗(yàn)，盡管其對(duì)大于1 cm 的腺瘤性息肉特異性達(dá)97.3%，但敏感性僅29.5%［15］。筆者旨在探究IL-18 及ASC、Caspase-1、IL-1β 等炎癥因子在腺瘤性息肉患者的血清和息肉組織中的表達(dá)量，通過對(duì)以上指標(biāo)的檢測(cè)來分析并監(jiān)測(cè)腸息肉-腺瘤性息肉-腸癌的疾病演變過程。

目前IL-18、炎癥小體及其形成過程中的炎癥因子如ASC、Caspase-1、IL-1β 在腫瘤形成機(jī)制中是促進(jìn)作用還是抑制作用存在爭議［10］。WANG［16］等指出TNF-α、TGF-β、IL-10 等炎癥因子在炎癥驅(qū)動(dòng)的腸道癌變機(jī)制過程中，作為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的腫瘤啟動(dòng)子。有報(bào)道證實(shí)NLRP3、IL-18 對(duì)淋巴瘤細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、抑制凋亡的效應(yīng)，具有一定致癌作用［17］。也有人認(rèn)為TGF-β［18］、IL-10［19］具有抑制腸癌進(jìn)展的作用。而本研究顯示腺瘤性息肉中的NLRP3、active Caspase-1、IL-1β 均比非腺瘤性息肉和正常腸粘膜中表達(dá)明顯增強(qiáng)，炎癥因子或相關(guān)通路的激活參與腺瘤性息肉發(fā)展過程，上述結(jié)果可推測(cè)其在腺瘤性息肉向腸癌發(fā)展的過程起促進(jìn)作用，我們擬收集一定量腸癌患者的血清及組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，來探究甚至驗(yàn)證IL-18、炎癥小體對(duì)腺瘤性息肉進(jìn)展為腸道腫瘤形成過程的作用。

IL-18 最初發(fā)現(xiàn)被稱為IFN-γ 誘生因子（IGIF），能促進(jìn)T 細(xì)胞或NK 細(xì)胞中IFN-γ 的生成，還可促進(jìn)NK 細(xì)胞、CD4+NKT 細(xì)胞、Th1 細(xì)胞等產(chǎn)生各種炎癥因子，IL-18對(duì)機(jī)體的先天免疫和獲得性免疫過程都具刺激作用［20］。有實(shí)驗(yàn)表明NLRP3 下游產(chǎn)生的IL-18 能抑制DSS/AOM 誘導(dǎo)的腸炎相關(guān)性腸癌的形成，減少腸道的腫瘤負(fù)荷［21］，但同時(shí)Rajendra Karki 發(fā)現(xiàn)過多炎癥小體的產(chǎn)生會(huì)抑制抗腫瘤免疫過程［22］。徐彤等［23］研究發(fā)現(xiàn)IL-18 通過上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞的FasL 表達(dá)，能增加結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的形成。故IL-18 在腸癌形成過程的作用仍有待商議。本研究發(fā)現(xiàn)IL-18 在腺瘤性息肉患者血清表達(dá)量較其余兩組明顯上調(diào)，而三組間IL-1β表達(dá)量無明顯差異。另外本研究在腸鏡下觀察到，非腺瘤息肉直徑多＜1.0 cm，形態(tài)為隆起或扁平樣較多，腺瘤性息肉血管增多且明顯擴(kuò)張。息肉切片的病理結(jié)果提示腺瘤性息肉的細(xì)胞核變長，腺腔拉伸。免疫組化顯示腺瘤性息肉中IL-18表達(dá)明顯增強(qiáng)，Ki-67 指數(shù)也隨之升高，以上幾項(xiàng)結(jié)果均提示IL-18 在腺瘤性息肉癌變過程中存在重要作用，腺瘤性息肉是一種癌前病變，推測(cè)若監(jiān)測(cè)普通人群血清中IL-18 的含量可發(fā)現(xiàn)大腸腺瘤性息肉的存在，在不進(jìn)行腸鏡檢查的前提下監(jiān)控它的復(fù)發(fā)，甚至預(yù)防腸癌的發(fā)生。

總之，針對(duì)IL18 的抗癌、促癌作用一直爭議不斷，經(jīng)本研究顯示IL18、IL-1β、NLRP3、Activecaspase-1（p20）在腺瘤性息肉患者的血清和息肉組織中表達(dá)均較對(duì)照組、非腺瘤息肉組患者明顯升高，提示IL-18 及IL-1β、NLRP3、Caspase-1 等炎癥因子參與腺瘤性息肉發(fā)生發(fā)展過程，也可能在腺瘤性息肉癌變過程存在促進(jìn)作用，因此筆者會(huì)擴(kuò)大研究的患者例數(shù)，另外加入相當(dāng)例數(shù)的腸癌患者組進(jìn)行相關(guān)研究。