程凱麗，胡志和*，趙旭飛，賈凌云，肖厚棟，丁新宇

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

牛乳富含碳水化合物、脂肪、蛋白質（如酪蛋白、乳清蛋白）、酶、維生素和礦物質等[1]。在原料乳生產和運輸期間，由于不潔的擠奶器皿和水、糞便和灰塵、不衛(wèi)生的車輛，原料乳常被微生物污染。一般采用巴氏滅菌法去除原料乳中的病原微生物，確保食用安全。但是，在熱處理過程中，對熱敏感的牛乳成分會發(fā)生許多物理和化學反應，從而對乳制品的感官特性（味道和風味）和營養(yǎng)價值產生負面影響[2]。這些影響促使人們在研究和工業(yè)環(huán)境中使用具有更短處理時間和最少熱量的新技術，而超高壓技術無需額外的熱處理就可以殺死食品中的多種致病菌[3]，同時延長牛乳保質期，提高牛乳可加工性[4]。鮑志英[5]針對鮮牛乳中的大腸埃希氏菌、豬霍亂沙門氏菌豬霍亂亞種和金黃色葡萄球菌，進行不同壓力（100～600 MPa）、不同時間（5～20 min）的處理，分析測定鮮牛乳中幾種病原菌經超高壓處理前后菌數的變化，發(fā)現超高壓處理可以快速、高效地殺死食品中的絕大多數細菌。Jermann等[6]也證明，超高壓處理可以在環(huán)境溫度下有效地滅活微生物。

從膠體角度來看，牛乳是蛋白質（主要是酪蛋白和乳清蛋白）、乳化脂肪滴、乳糖和礦物質在水介質中的穩(wěn)定懸浮液[7]。酪蛋白是牛乳中最主要的蛋白質，占牛乳總蛋白質的80%左右[8]，酪蛋白主要由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-酪蛋白組成，再經過α-螺旋、β-折疊等方式構成酪蛋白的空間結構。酪蛋白以酪蛋白膠束的形式存在于牛乳中，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白在N末端和C末端均有疏水區(qū)域；αs2-酪蛋白是親水性蛋白，其在N末端后疏水區(qū)與親水區(qū)交替。雖然αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-酪蛋白的氨基酸、磷和碳水化合物含量不同，但它們表現出的親水性相似[9]。與酪蛋白相比，乳清蛋白的天然構象相對親水，并以小球狀蛋白形式存在[10]。在劇烈的環(huán)境（pH值、溫度、剪切力等）變化中，牛乳蛋白會變性，埋在天然結構中并參與蛋白質間相互作用的疏水位點和活性氨基酸殘基暴露。

為延長牛乳保質期并打破地域限制，牛乳被制成多種乳制品，如乳粉、干酪、煉乳和冰激凌等。有時，將牛乳轉化為其他乳制品需要加入酶。例如，干酪加工過程中添加凝乳酶能夠破壞酪蛋白膠束的穩(wěn)定性，使副酪蛋白的微粒發(fā)生團聚作用而產生凝膠體副酪蛋白鈣[11]。乳糖酶可用于生產低乳糖乳制品，供乳糖不耐受人群食用，使乳中營養(yǎng)成分易于被人體吸收并有較好口感[12]。乳清是生產干酪和干酪素的副產品，含有乳糖、維生素和乳清蛋白等營養(yǎng)成分，利用乳糖酶可將乳清中的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，用以制造乳清糖漿或作為添加劑添加到食品中，從而達到綜合開發(fā)利用乳清資源、減少環(huán)境污染的目的[13-14]。

近年來，超高壓技術在乳制品加工中的應用日益普及，超高壓處理對乳制品中蛋白質和酶活性的影響也逐漸引起人們注意，但這方面的報道較少。本文總結乳制品加工中超高壓技術應用的最新進展，重點論述其對乳制品中蛋白質和酶的影響。

1 超高壓處理原理

超高壓處理是在環(huán)境溫度下施加100～1 000 MPa壓力，以達到滅活包括營養(yǎng)細菌、酵母菌和霉菌在內的病原微生物、鈍化酶的活性、延長食品保藏期的目的。超高壓處理是一個物理過程，在食品加工中主要利用勒夏特列原理（Le Chatelier’s principle）和帕斯卡定律。根據勒夏特列原理，化學平衡是動態(tài)平衡，如果改變影響平衡的一個因素，平衡就向能夠減弱這種改變的方向移動，以抗衡這種改變[15]。帕斯卡定律指的是壓力的傳遞是均勻且瞬時的，與食物的大小和幾何形狀無關。在工業(yè)應用中，根據食物類型的不同，處理時間可能從2～30 min不等[16]。盡管壓力是在環(huán)境溫度下施加的，但由于絕熱加熱，壓力每升高100 MPa，溫度會升高3～9 ℃（取決于壓力傳遞液和處理時間）[17]。在超高壓處理中，壓力容器中裝有食品，并在所需的時間內施加壓力，然后減壓，可將流程簡化表述為放入食品→加壓→保壓→卸壓→取出食品。

高壓處理可以分批，也可以采用半連續(xù)或連續(xù)模式進行。在分批處理過程，即靜態(tài)超高壓（high hydrostatic pressure，HHP）處理中，將預包裝的食物放入壓力室，然后密封，將水泵入腔室以排出所有空氣，使腔室內積聚壓力，直到達到指定的極限。在特定的時間-壓力組合下，對產品進行加壓和保壓，并在完成后打開卸壓閥，將腔室減壓，然后取出加工食品（圖1）。加壓所需的時間受壓力介質和食物材料的性質影響。一般以水作為壓力傳遞介質，既可縮短加壓時間，使產品中的壓力保持均勻，又可保持壓艙清潔[18]。與其他形式的處理相比，分批處理將預包裝食品放入容器，防止了交叉污染的風險，與半連續(xù)和連續(xù)處理相比，不需要在運行過程中以及對設備與設備間進行清理，具有高效性和簡便性，因此分批高壓處理是首選。

圖1 用于分批高壓處理的典型設備[18]Fig. 1Schematic diagram of the typical equipment used for batch high pressure processing[18]

連續(xù)處理模式，即超高壓均質（ultra-high pressure homogenization，HUPH）處理食品的時間很短，可能導致化學和物理化學性質的變化，包括亞微米/納米顆粒的形成，也可能會影響食物的生理或毒理特性[19]。與HHP相比，HUPH過程中，液體食品通過移動的活塞被引入并在腔室內完成加壓-保壓-卸壓（圖2），在特定時間段內，減壓液體食品傳送到無菌罐進行貯存或裝運[20-21]。

圖2 用于半連續(xù)高壓處理的多容器裝置[22]Fig. 2 Schematic diagram of the multi-container unit used for semi-continuous high pressure processing[22]

2 超高壓處理對乳蛋白結構及功能的影響

2.1 超高壓處理對乳清蛋白結構的影響

在天然狀態(tài)下，蛋白質之間通過共價鍵、靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用而穩(wěn)定。在相對較低的溫度下（0～40 ℃），共價鍵幾乎不受超高壓處理的影響。因此，蛋白質的一級結構在超高壓處理期間保持完整[23]。靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用會影響乳蛋白的二級、三級和四級結構。不同作用力對高壓處理的敏感性順序為疏水相互作用＞靜電相互作用＞氫鍵＞共價鍵。刁小琴等[24]發(fā)現，高壓均質處理能夠改變蛋白質的二級結構，α-螺旋和β-折疊相對含量減少，β-轉角和無規(guī)卷曲相對含量增加。Goyal等[23]研究壓力對蛋白質溶液總體密度的影響時發(fā)現，壓力增加了蛋白質周圍水的密度，且改變了蛋白質與水分子之間的氫鍵網絡結構。在200 MPa以上的壓力下，水分子開始滲透到蛋白質內部，壓力大于600 MPa時，蛋白質結構發(fā)生顯著變化[25-27]。Best[28]、Moir[29]等通過模擬實驗研究壓力對蛋白質α-螺旋結構穩(wěn)定性的影響，觀察到隨著壓力的增加，尤其是在100 MPa以上時，壓力與α-螺旋的穩(wěn)定性呈正相關。

2.1.1 超高壓處理對β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）結構的影響

乳清蛋白在高壓下的結構變化對于乳及乳制品尤為重要。β-Lg是牛乳中含量最豐富的乳清蛋白[30]，是一種壓敏性球狀乳清蛋白（含有2 個分子內二硫鍵和1 個游離巰基），以二聚體形式存在于牛乳中。Vibeke等[31]曾提出壓力對β-Lg的作用機理：當施加壓力時，β-Lg天然結構展開，從而增加了蛋白質骨架對構象變化的靈活性，并允許水分子滲透到小球的疏水內部；在高壓條件下，溶劑和蛋白質之間的水合作用將蛋白質構象轉變?yōu)椴痪哂腥壗Y構的熔球，如果保持恒定的壓力，熔球結構可能會持續(xù)存在，但隨著壓力的增加，蛋白質變性，形成聚集體（圖3）。Blayo等[32]詳細描述了高壓均質處理對β-Lg產生的影響，同時發(fā)現蛋白質結構變化和蛋白質水解速率存在一定的關系；雖然β-Lg在生理條件下（0.1 MPa、pH 3～4）可以抵抗消化水解作用，但在300 MPa或更高壓力下，其水解速率也會大大提高。Garcia-Mora等[33]發(fā)現，壓力輔助的蛋白水解作用伴隨著β-Lg抗原活性的降低和分離乳清蛋白水解產物的產生，蛋白酶在300 MPa時產生的水解物具有抗炎或抗氧化特性。Goyal等[34]指出，β-Lg在100～400 MPa壓力下會展開，從而使游離巰基暴露，壓力高于400 MPa時，β-Lg發(fā)生大量變性，暴露的巰基往往會與其他乳蛋白形成二硫鍵。Ambrosi等[35]也有類似發(fā)現，他們同時發(fā)現當HHP與酶水解結合使用時，蛋白質變性可能會誘導進一步的肽鍵裂解，從而對乳清蛋白抗原產生潛在的影響，進而對其抗原能力產生潛在影響。

圖3 β-Lg的壓力誘導變性示意圖[31]Fig. 3 Schematic diagram of pressure-induced denaturation of β-Lg[31]

2.1.2 超高壓處理對α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）結構的影響

α-La也是乳清蛋白的主要成分之一[36]，含有5 個酪氨酸殘基和3 個色氨酸殘基[37]。牛乳中α-La的含量在1.2～1.5 g/L之間變化，α-La是乳清蛋白組分中僅次于β-Lg的第二大成分（20%）。與β-Lg相比，α-La含有4 個分子內二硫鍵，沒有游離巰基，并且表現出特征性最強的熔球態(tài)，具有很高的穩(wěn)定性，因此在壓力下更不易變性[38]。Rodiles-López等[38-39]研究高壓對α-La功能特性的影響時發(fā)現，在600 MPa、55 ℃條件下處理10 min，α-La的溶解度、發(fā)泡能力、泡沫穩(wěn)定性、乳化活性指數和乳液穩(wěn)定性均出現不同程度的提高；進一步研究HHP處理對α-La某些結構特性的影響，發(fā)現隨著壓力的增加，α-螺旋結構相對含量降低，而β-折疊結構相對含量增加，在不同pH值條件下，高壓處理可獲得具有不同功能特性的熔球結構。Zou Hui等[37]研究高壓處理對α-La與天竺葵素-3-葡萄糖結合相互作用的影響，發(fā)現高壓處理使α-La結合位點的卷曲結構和位置及殘基結構受到影響，但沒有改變α-La的典型Ca2+結合位點。

2.2 超高壓處理對酪蛋白結構的影響

與高壓誘導乳清蛋白展開（即二級和三級結構的變化）不同，酪蛋白在高壓處理下的變化研究主要集中在膠束的解離。高壓處理可以改變酪蛋白膠束的彈性結構。膠體磷酸鈣負責交聯酪蛋白并中和帶負電荷的磷酸絲氨酸基團[40]，在高壓條件下會發(fā)生增溶，因此膠束的穩(wěn)定性受到破壞；酪蛋白膠束結構中的疏水和靜電相互作用遭到破壞，致使酪蛋白膠束中的酪蛋白單體分子無法結合[41]。趙正濤等[42]研究發(fā)現，乳清中的鈣離子含量、蛋白質含量及種類均能對酪蛋白凝膠結構的形成及特性產生影響。Cadesky等[43]研究高壓處理酪蛋白膠束引起的結構變化時發(fā)現，經過150～450 MPa壓力處理后，可溶性鈣結合的αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白含量增加，350 MPa條件下可溶性鈣和磷含量增加，而450 MPa條件下可溶性鈣和磷含量呈現降低趨勢，可能是由于壓力導致磷酸鈣的解離，隨后酪蛋白膠束變得不穩(wěn)定。由于分子質量相似，使用常規(guī)分離技術分離β-Lg和α-La仍然具有挑戰(zhàn)性。Marciniak等[44]研究發(fā)現，在高靜水壓下酪蛋白含量的增加對β-Lg的聚集具有顯著影響，而α-La則不受影響，由此特性可分離β-Lg和α-La。

3 超高壓處理對乳制品中酶活性的影響

牛乳中大約含有30多種酶類，這些天然酶類主要來源于乳腺細胞，包括脂肪酶、蛋白酶、黃嘌呤氧化酶和乳過氧化物酶等。同時，在乳制品加工過程中人工添加的酶類也有非常重要的作用，如干酪加工時添加的凝乳酶等。酶的本質是蛋白質，其生物學活性取決于分子3D結構產生的特異性位點。因此，酶結構的任何改變都可能改變酶的活性。實際上，HHP處理對疏水鍵和離子鍵的影響很大，而對共價鍵的影響很小，HHP處理會破壞相對較弱的化學鍵（圖4），導致蛋白質解折疊或變性[45]。因此，HHP處理可以改變酶-底物（蛋白質）的相互作用和水解速率。Sakharam等[46]發(fā)現，較低的壓力（通常為小于350 MPa，取決于酶的類型和處理溫度）可以激活酶，而較高的壓力（＞400 MPa）會導致酶的失活，推測低壓處理能夠增加氫鍵數量，而較高的壓力會破壞疏水鍵、氫鍵和離子鍵等弱鍵。因此，HHP能夠特異性地影響蛋白質二級結構，并且結構修飾可以是可逆或不可逆的，這取決于加壓參數和蛋白質的性質[47]。

圖4 HHP對蛋白質中弱鍵和共價鍵的影響[45]Fig. 4Effect of HHP on weak bonds and covalent bonds in proteins[45]

3.1 超高壓處理對乳過氧化物酶活性的影響

乳過氧化物酶是一種存在于人和其他哺乳動物乳汁分泌物中的抗菌糖蛋白[48]，在過氧化氫存在的條件下，乳過氧化物酶能將硫氰酸鹽氧化成抗菌化合物，從而能夠殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，生產中一般用于牛乳保鮮。Mazri等[49]研究HHP對脫脂乳和乳清中存在的乳過氧化物酶變性的影響，發(fā)現牛乳中的乳過氧化物酶在400 MPa條件下緩慢變性，在高于700 MPa的壓力下迅速變性。Pinho等[50]研究HUPH對生脫脂牛乳中乳過氧化物酶活性的影響時發(fā)現，在100～250 MPa壓力下，酶活力增加約20%，而在300 MPa的壓力下酶活力降低約30%。乳過氧化物酶活性的增加可能歸因于酶三維結構的變化而導致的活性位點暴露，而酶活性降低可能由于處理過程中壓力和溫度的共同作用。

3.2 超高壓處理對乳脂肪酶活性的影響

脂肪酶可水解乳脂肪中的甘油三酯為甘油二酯、甘油單酯、脂肪酸和甘油，這些成分是乳味香精中酸味和干酪味的主要來源，因此乳脂肪酶一般用于乳品增香[51]。脂肪酶可用于水解乳脂，制備天然乳味香基[52]，在壓力450 MPa、溫度45 ℃、pH 7.5、保壓時間10 min條件下，加壓處理可使脂肪酶活性提高220%，隨著保壓時間的延長，經高壓處理的脂肪酶活力先上升后下降，而隨著貯藏時間的延長，酶活力先下降，之后保持穩(wěn)定，高壓解除后，脂肪酶構象能夠部分恢復[53]。Serra等[54]研究HHP對酸乳貯藏過程中脂肪分解的影響，在200、300 MPa條件下對牛乳進行HHP處理，采用處理后牛乳制備的酸乳和采用常規(guī)牛乳制備的酸乳游離脂肪酸變化曲線相似，此外，HHP處理過的酸乳從貯藏第1天開始就觀察到更高水平的游離脂肪酸。

3.3 超高壓處理對乳中蛋白水解酶活性的影響

乳中有多種蛋白酶，牛乳中的蛋白酶水解乳蛋白生成肽和氨基酸，其中纖維蛋白酶對乳及乳制品的品質影響很大，其在乳中也起著水解乳蛋白的作用。Scollard等[55]在牛乳HHP處理后立即測定纖維蛋白酶活性，發(fā)現在400 MPa壓力下處理過的牛乳纖維蛋白酶活性降低，在300～500 MPa壓力下進行HHP處理可能會增加膠束結構，從而促進底物與纖維蛋白酶的結合，提高牛乳的蛋白水解能力。乳蛋白酶中的胰蛋白酶和糜蛋白酶都有分解蛋白質的功能，二者同時作用可將蛋白質分解為小分子的多肽和氨基酸。Izquierdo等[56]研究HHP處理后鏈霉蛋白酶和α-糜蛋白酶對牛乳中β-Lg抗體的影響，結果表明，在100～300 MPa之間進行高壓處理，可增加鏈霉蛋白酶和α-糜蛋白酶的初始水解速率，在更高壓力下，β-Lg抗體可被鏈霉蛋白酶和α-糜蛋白酶完全水解。Marciniak等[57]總結近年來文獻報道的HHP相關研究認為，HHP可促進食品蛋白質的酶解和生物活性肽（bioactive peptides，BPs）的生產。酶促水解（enzymatic hydrolysis，EH）由于具有大眾安全健康食品特性而被廣泛應用，然而為提高BPs的產量和生物活性，EH需要減少酶水解的時間和數量。HHP能夠提高蛋白酶的水解效率，并從各種復雜的生物質中產生高附加值的肽級分。利用HHP作為預處理來破壞牛乳蛋白的穩(wěn)定性，以提高其對酶解的敏感性，高靜壓輔助酶解（high hydrostatic pressure-enzymatic hydrolysis，HHP-EH）會顯著改變水解產物的肽譜，從而產生新的肽種類并增加特定肽的含量，且HHP-EH生成的肽具有更高的生物活性（圖5）。

圖5 不同作用條件下天然蛋白酶促水解產生肽的機制[47]Fig. 5 Mechanism of formation of peptides catalyzed by natural proteases under different conditions[47]

3.4 超高壓處理對乳中凝乳酶活性的影響

凝乳酶是天冬氨酸蛋白酶的一種，可破壞酪蛋白膠束，使牛乳凝結，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成為干酪生產中形成質構和特殊風味的關鍵性酶，被廣泛應用于干酪和酸乳的制作。Mozhaev等[58]發(fā)現，對于胰凝乳蛋白酶，在360 MPa壓力下，其活力可以提高將近30 倍。de Castro等[59]曾報道，25 ℃環(huán)境下，小牛凝乳酶在175～285 MPa的壓力下保壓14～23 min，其蛋白水解活性和凝乳活性分別提高23%和17%；此外，凝乳過程中，280 MPa壓力下加壓20 min的小牛凝乳酶儲能模量（G’）高于未經處理的酶，加壓90 min后G’增加25.8%，因此使用HPP預處理小牛凝乳酶可加速牛乳的凝結并產生更牢固、更均勻的凝膠；隨后研究HHP對牛凝乳酶的影響時得出結論，在23 ℃條件下，經222 MPa壓力加壓5 min，凝乳酶活力最大；HPP在高溫（40 ℃）高壓（500 MPa）條件下促進凝乳酶失活，而在低壓（325 MPa）條件下，相對蛋白水解活性和相對凝乳活性升高。

4 結語

食品工業(yè)轉向新興技術的原因主要是提高使用質量或增加附加值，以及改善食品安全問題和延長產品的貨架期。HPP加工是一種相對成熟的技術，已廣泛用于食品加工中，與其他新興技術相比，HPP是未來10 年最具有商業(yè)價值的技術。牛乳蛋白的理化特性和功能特性可以通過HPP技術改變，與傳統(tǒng)熱加工相比，在殺滅乳中污染的微生物、滅活各種酶的同時，HPP技術可顯著提高牛乳食用品質。盡管近年來HPP技術的應用已在許多國家取得相當大的進展，但是當前仍有許多待解決的問題，如設備龐大、基建費用高、成本較高等。乳業(yè)對新技術的適應是一個緩慢的過程，需要進一步研究，以在乳業(yè)和其他食品工業(yè)中有效實施這些技術。