陳拓宇 栗琳 趙忙所 薛超強 張玉琪

釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP）是臨床最常見的顱咽管瘤類型，兒童大多都是ACP，而成人約1/6 為鱗狀乳頭型顱咽管瘤（squamous papillary craniopharyngioma，SPCP），其余為ACP[1]。臨床上ACP 的生物學特性導致其手術難度大、并發(fā)癥多，術后復發(fā)率高。因此，ACP 是否具有侵襲性一直是研究的熱點，國內(nèi)外學者都在試圖探尋一種能判斷ACP 侵襲性強弱或可隨訪的指標。熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α，Hsp90α）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能界定腫瘤侵襲性強弱的標志物，已通過血漿檢測，在肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤患者體內(nèi)被檢測確定，但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的研究還是空白[2]。本研究主要運用ELISA 法，定量檢測、分析患者血漿及腦脊液中Hsp90α 含量的差異，結(jié)合Western blot 法血漿檢測結(jié)果與病理診斷，研究ACP 是否具有侵襲性及其侵襲性強弱，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、分組及入組標準

選取自2014 年7 月至2015 年10 月清華大學玉泉醫(yī)院神經(jīng)外科手術治療的患者為研究對象，分為4 組，其中3 組為顱內(nèi)腫瘤患者[ACP 組、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）組、脈絡叢乳頭狀瘤（choroid plexus papilloma，CPP）組]，1 組為顱骨修補患者。（1）顱內(nèi)腫瘤患者均需經(jīng)術后病理學確診，為WHO Ⅰ級的ACP 或WHO Ⅳ級的GBM 或WHO Ⅰ級的典型CPP。排除不能承受或拒絕行腰椎穿刺留取腦脊液的患者；是否為首發(fā)腫瘤未設要求。（2）顱骨缺損對照組：患者為外傷后行去骨瓣減壓術后行顱骨修補的患者，無腦內(nèi)器質(zhì)性病變，骨瓣減壓術后≥3個月，傷口已完全愈合，無感染、炎癥、出血、腦水腫或腦積水等；術前血漿C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）在正常范圍內(nèi)。（3）所有患者的年齡、性別均不限。（4）本研究方案提請醫(yī)院醫(yī)學道德委員會審查并通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

二、一般資料

納入患者32 例。ACP 組患者14 例，其中男性8例，女性6 例；年齡范圍5～53 歲，平均17.7 歲；首發(fā)ACP 7 例，復發(fā)ACP 7 例（3 例經(jīng)過放療后復發(fā)）。GBM 組患者6 例，男性3 例，女性3 例，年齡范圍49～76 歲，平均60.5 歲，其中首發(fā)GBM 5 例，復發(fā)GBM 1 例（經(jīng)過化療后近半年再次復發(fā)）。CPP 組患者6 例，男性4 例，女性2 例，年齡范圍5 個月～4歲，平均19 個月，均為首發(fā)腫瘤。顱骨缺損對照組患者6 例，其中男性4 例，女性2 例，年齡范圍3～12歲，平均8.3 歲；顱骨缺損均為外傷所致，其中3 例車禍傷，2 例墜落傷，1 例鈍器傷；受傷時間最短4 個月，最長3 年，平均1 年9 個月。

三、標本采集

（1）血漿標本：入組患者均在清晨未進食狀態(tài)下用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管采集10 mL 靜脈血，并盡快在低溫條件下送至實驗室離心（4℃、1300 g、10 min），取上層血漿備用。（2）腦脊液標本：為避免術中留取腦脊液時誤將血漿成分混入腦脊液，均采用全身麻醉后，于開顱前在手術臺上行腰椎穿刺術留取腦脊液10 mL，余步驟同前。

四、血漿及腦脊液Hsp90α 含量測量

用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 法）實驗定量測量上述4 組患者的血漿及腦脊液Hsp90α 含量。血漿樣本高速離心（4℃、14 000 g、10 min）后取上清100 μL，腦脊液以同樣方法取100 μL，用于Hsp90α 定量檢測試劑盒（煙臺普羅吉生物發(fā)展有限公司）的檢測，檢測步驟嚴格遵從試劑盒使用說明書。ELISA 樣本檢測通過跟試劑盒內(nèi)自帶的5 個濃度樣本所作出的標準曲線作對比，用酶標儀進行讀數(shù)。

五、Western blot 測定血漿中Hsp90α 和Actin蛋白的含量

采用蛋白免疫印跡法（Western blot 法）檢測上述患者血漿中Hsp90α 和Actin 蛋白的含量，用以輔證ELISA 結(jié)果。7 mol/L 尿素萃取液以4∶1 的比例加入臨床樣本中，混勻震蕩，用于蛋白萃取。離心后取上清1 μL，用bradford 法測定其蛋白含量。定量后將50 μg 蛋白于10%的SDS-PAGE 凝膠電泳，分離蛋白，之后轉(zhuǎn)至孔徑為0.45 nm 的PVDF 膜上，并用脫脂牛奶封閉2 h（常溫）。一抗分別是鼠抗人Hsp90α（Abcam 公司，英國）1∶1000 稀釋和鼠抗人Actin（Sigma 公司，美國）1∶1000 稀釋，37℃孵育4 h，之后用TBST 洗3 次，每次10 min，之后加入兔抗鼠二抗（Sigma 公司，美國），室溫孵育1 h，經(jīng)Odesssy曝光儀自動生成Western blot 中各條帶的相對灰度值，并利用其自帶軟件將灰度值轉(zhuǎn)化為柱狀圖，并自動計算每組樣本的平均值及標準差。

六、病理學檢查

術中切除的腫瘤標本均在2 h 內(nèi)固定于4%多聚甲醛過夜，石蠟包埋后切片，進行HE 染色，肉眼光學顯微鏡下判讀，再由免疫組織化學定性診斷。入組的顱咽管瘤必須是ACP，并為WHO Ⅰ級；膠質(zhì)瘤必須是GBM，并為WHO Ⅳ級；脈絡叢腫瘤必須是CPP，且為WHO Ⅰ級。復發(fā)ACP 患者增加對腫瘤外層邊界的病理切片、HE 染色，觀察其對周圍腦組織的浸潤程度。

七、統(tǒng)計學分析

運用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)進行Kolmogorov-Smirnov（K-S）正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，4 組間比較采用方差分析，兩兩比較采用多重比較，原發(fā)和復發(fā)ACP 患者Hsp90α 含量的對比采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、ELISA 法檢測4 組患者血漿和腦脊液中Hsp90α 的含量

所有入組患者體內(nèi)均能產(chǎn)生一定量的Hsp90α，其能通過血-腦屏障、血-腦脊液屏障等生理屏障等進入外周血液循環(huán)中而被檢測出來。顱內(nèi)腫瘤患者無論是血漿還是腦脊液中的Hsp90α 水平均遠高于顱骨缺損對照組患者，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。血漿中Hsp90α 含量高低：GBM 組＞ACP組＞CPP 組=顱骨缺損對照組；腦脊液中Hsp90α 含量高低：GBM 組＞ACP 組＞CPP 組=顱骨缺損對照組（圖1A～B）。復發(fā)ACP 患者血漿中Hsp90α 含量水平顯著高于原發(fā)ACP 患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而腦脊液中的Hsp90α 含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1C～D）。

表1 4 組患者血漿和腦脊液中Hsp90α 蛋白的含量（ng/mL，Mean±SD）

二、Western blot 法血漿驗證結(jié)果

觀察各組患者的Western blot 在90 000 上的灰度值直觀上即有一定區(qū)別（圖2A）。經(jīng)Odesssy 曝光儀利用其自帶軟件將灰度值轉(zhuǎn)化為柱狀圖，在排除樣本數(shù)干擾的前提下，入組顱內(nèi)腫瘤（ACP、GBM 及CPP）患者血漿中的Hsp90α 水平均高于作為顱骨缺損對照組（圖2B）。

三、病理結(jié)果

術后病理診斷證實ACP、GBM 和CPP 的腫瘤分型及WHO 分級。ACP 病理結(jié)果顯示典型腫瘤外膜附近的組織結(jié)構，除可見ACP 浸潤鄰近組織時引起的膠質(zhì)細胞反應增生帶（Rosenthal 纖維）外，還可見腫瘤向外“侵襲”的跡象，即可見ACP 最外層擁有多尖邊緣和不規(guī)則突起形狀，呈“舌樣”或“島樣”，正在突破腫瘤基膜，侵犯周圍正常組織（圖3）。

討論

顱咽管瘤屬于先天性的上皮成分起源腫瘤，一直被認為是“純”良性腫瘤。在WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，顱咽管瘤的兩個病理亞型（ACP 和SPCP）均被定為WHO Ⅰ級[3-5]。GBM 是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，為WHO Ⅳ級，其約占顱內(nèi)腫瘤的12%～15%[5]。典型的CPP 為起源于腦室內(nèi)脈絡叢上皮細胞的良性腫瘤，為WHO Ⅰ級，約占兒童顱內(nèi)腫瘤的2%～4%[6]。因此CPP 和GBM 可代表最典型的良/惡性腫瘤。本研究中將ACP 與最典型的良/惡性腫瘤進行研究對照，能對其生物學性質(zhì)，特別是侵襲性有深入了解。

圖1 4 組患者血漿和腦脊液Hsp90α 含量ELISA 檢測

圖2 4 組患者血漿中Hsp90α 蛋白Western blot 檢測結(jié)果

圖3 復發(fā)的造釉細胞型顱咽管瘤病理資料（HE 染色，×100）

腫瘤侵襲也稱腫瘤浸潤，是指腫瘤細胞突破外層基底膜并向四周正常組織浸潤性生長、侵犯的過程。臨床上ACP 常表現(xiàn)出對下丘腦、視神經(jīng)、垂體柄等重要結(jié)構侵襲性生長的生物學行為，預后明顯較差。但侵襲性顱咽管瘤這一稱呼至今在國際上并沒得到正式承認，只是部分ACP 在電子顯微鏡下能證實其腫瘤細胞能呈“島樣”、“手指狀”、“舌頭樣”等聚集，突破腫瘤基膜，侵入周圍正常腦組織中，且腫瘤外周具有纖維膠質(zhì)組織（即Rosenthal 纖維）環(huán)繞，因此部分病理學家才稱之為侵襲性顱咽管瘤[7]。目前顱咽管瘤是否具有侵襲性只有術后病理診斷才能確認，對臨床手術無指導意義。因此，探索一種兼顧“預判”及“隨訪”功能，并指導手術的檢驗指標就成了本研究的目的。此檢驗指標應具有以下特點：（1）標本取材盡量對患者創(chuàng)傷小、痛苦少；（2）取材操作簡便易行，可普及；（3）檢驗硬件要求一般，過程耗時少、價格低；（4）檢驗結(jié)果通俗易懂、可量化。

Hsp90α 是機體細胞中普遍存在的一種蛋白質(zhì)，其主要作用是維持細胞新陳代謝，促進細胞生長與增殖[8]。在病理或應激條件下正常細胞可向外分泌超量的Hsp90α，通過毛細血管網(wǎng)或毛細淋巴管進入血漿循環(huán)，使之能在血漿中被檢測出來[9]。研究表明，Hsp90α 可在應激狀態(tài)下表達于正常的神經(jīng)細胞、皮膚鱗狀上皮細胞或血漿中的免疫細胞的細胞膜表面[10,11]。腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展對于正常機體來說也是一種應激狀態(tài)。有研究表明，在腫瘤細胞中，突變或異常蛋白可刺激Hsp90α 的高表達，達正常水平的2～10 倍以上，同時Hsp90α 還能正反饋的加速腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)歸[12]。國內(nèi)有學者發(fā)現(xiàn)，Hsp90α 在不同分化程度胃癌中的表達程度不同，在中、高度分化胃癌中的表達較低分化胃癌中的表達明顯（P＜0.05）；而印戒細胞癌中的表達明顯低于中高分化癌和低分化癌（P＜0.05）[13]。Pick 等[14]的研究表明，乳腺癌中Hsp90α 高表達跟患者術后生存時間有明顯關系。Wang 等[15]研究直接指出Hsp90α 的表達高低預示著胃癌的侵襲程度，指導著患者預后。

目前，尚無學者直接從血漿及腦脊液中提取Hsp90α，通過測量其表達，研究顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的良惡性或侵襲度。本研究在運用ELISA 法檢測Hsp90α 時，均參照清華大學腫瘤分子實驗室的研究經(jīng)驗，即正常人群血漿中Hsp90α 含量應＜50。這說明本研究取顱骨修補患者作為正常對照組應符合入組條件，而且使正常人群入組，無論是在抽血還是腰椎穿刺獲取腦脊液都有技術或倫理學上的困難。

本研究中所有入組腫瘤患者（ACP、GBM）血漿及腦脊液中Hsp90α 含量均遠高于顱骨缺損對照組。此結(jié)果也印證了顱內(nèi)腫瘤，無論良性、惡性腫瘤，均對患者是一種“應激”狀態(tài)，可使其體內(nèi)高表達Hsp90α。在顱內(nèi)腫瘤患者中，無論血漿還是腦脊液中的Hsp90α 含量，GBM 組＞ACP 組＞CPP 組=顱骨缺損對照組，這一結(jié)果或許可以說明ACP 侵犯/浸潤周圍正常組織的能力介于良性和惡性腫瘤之間，具有相當?shù)那忠u性。筆者使用了Western blot 法對以上推測進行了驗證，并通過Odesssy 自動曝光儀的自帶軟件生成柱狀圖，表明在不考慮病例數(shù)的情況下，ACP 血漿中Hsp90α 含量介于GBM 與CPP 之間，且遠大于顱骨缺損對照組。但ACP 與CPP 同為WHO 分類中的Ⅰ級腫瘤，其差異可能由于Hsp90α的分泌水平與腫瘤的侵襲性正相關，與病理分級無明顯關系。Hsp90α 在血漿、腦脊液中的含量越高，越能說明腫瘤對周圍腦組織的浸潤、侵襲程度越重。此結(jié)果印證了在實際手術操作中，ACP 因與周圍正常腦組織黏連緊密而較同為WHOⅠ級的CPP 更難切除，且術后復發(fā)率高。

上述結(jié)果并沒有將原發(fā)ACP 與復發(fā)ACP 進行分組對比，很難解釋到底是原發(fā)腫瘤侵襲還是因腫瘤復發(fā)，或是手術損傷影響了Hsp90α 水平的高低。因此，在對原發(fā)、復發(fā)ACP 患者的血漿及腦脊液的ELISA 檢測后，筆者發(fā)現(xiàn)復發(fā)ACP 中血漿Hsp90α水平明顯高于原發(fā)患者。但是腦脊液結(jié)果差異不明顯，可能原因有：（1）復發(fā)ACP 患者均做過手術，顱內(nèi)血腦屏障等生理屏障無論從生理學還是解剖學上都不完整，腫瘤細胞與外周血液循環(huán)之間存在部分直捷通路可能；（2）復發(fā)ACP 常原位復發(fā)，多因原腫瘤與周圍組織結(jié)構黏連不清，病理證實侵襲性生長的ACP 細胞本身會向周圍腦組織浸潤，突破基膜、破壞周圍毛細血管內(nèi)皮細胞。這樣ACP 細胞便能直接向血液循環(huán)中分泌Hsp90α，使血漿內(nèi)濃度相對高于腦脊液內(nèi)濃度。

值得注意的是，在單獨對比檢測中，CPP 患者與顱骨修補患者血漿及腦脊液中Hsp90α 含量差異無統(tǒng)計學意義。筆者考慮為典型的CPP 生長方式多為脈絡上皮細胞在腦室內(nèi)異常增殖，幾乎無核異型性，對周圍腦組織及血管、神經(jīng)基本無侵襲，手術難度主要體現(xiàn)對供血動脈及引流靜脈的阻斷及處理上，而且脈絡叢上皮細胞的最主要生理作用為分泌腦脊液，因此CPP 細胞直接向腦脊液中分泌大量的Hsp90α 是造成患者腦脊液中Hsp90α 含量相對高于血漿的原因，但還有待進一步大樣本實驗的支持。本研究因?qū)嶒炘O計原因未完成腦脊液的Western blot 檢測，需要后續(xù)研究完善。

綜上所述，探討顱咽管瘤的侵襲性是挑戰(zhàn)人們對此腫瘤的認知，而且本研究未從傳統(tǒng)病理研究入手，而是創(chuàng)新性地直接從術前血漿及腦脊液檢測入手，面臨更大的挑戰(zhàn)。在標本取樣時，腰椎穿刺、靜脈抽血、麻醉插管等操作對患者是一種“應激狀態(tài)”，因此，機體細胞分泌的Hsp90α 對實驗結(jié)果的影響有待進一步研究。對于ACP 患者術后Hsp90α 在血漿及腦脊液中的表達，或許能作為隨訪指標之一。