宋波 程云 姜玉章 沈沖 薛永 李嬰慧

出血性腦卒中（hemorrhagic stroke，HS）是腦血管疾病中的一組以腦部出血性損傷為主要臨床表現(xiàn)的疾病，具有發(fā)病率、病死率、致殘率及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。HS 也是腦卒中最嚴(yán)重的一種類型，其80%的患者6 個(gè)月后有不同程度的神經(jīng)功能障礙，生活不能自理[2]。但目前HS 具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是一種多功能的細(xì)胞因子，參與體內(nèi)多種病理和生理過(guò)程，可能通過(guò)免疫-炎癥調(diào)節(jié)、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用、促血管生成作用、損傷修復(fù)作用及抗凋亡作用減輕腦卒中后腦損傷，在急性腦血管病中發(fā)揮腦保護(hù)作用。在心血管系統(tǒng)中，TGFβ1 參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和血管重塑導(dǎo)致血管彈性下降、血管硬化從而增加血管破裂風(fēng)險(xiǎn)。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明人體TGF-β1 的水平與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。TGF-β1 通過(guò)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 受體1（transforming growth factor β receptor 1，TGFBR1）結(jié)合而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，當(dāng)TGFBR1 異常增加或者構(gòu)型改變時(shí)就會(huì)影響TGF-β1 的生物學(xué)效應(yīng)，從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。TGFBR1 由TGFBR1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)并受到結(jié)合該基因3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)的微小RNA-938（microRNA-938，miR-938）調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶TGFBR1 基因rs12346650 的A 等位基因個(gè)體的高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[8]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR1 基因變異在loeys-dietz 綜合征患者發(fā)生腦血管事件的病理機(jī)制中發(fā)揮重要功能[9]。本研究同時(shí)納入分析TGFBR1 基因rs12346650 位點(diǎn)和miR-938 基因（MIR938）少見(jiàn)等位基因型頻率＞0.05 的位點(diǎn)rs2505901，分析其多態(tài)性與HS的關(guān)系。

資料與方法

一、調(diào)查對(duì)象與調(diào)查內(nèi)容

本研究采用病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，以淮安市第一人民醫(yī)院和淮陰區(qū)醫(yī)院自2008 年1 月至2013 年7月收治的239 例急性HS 患者為病例組，993 例無(wú)腦卒中史的社區(qū)人群為對(duì)照組，按照年齡匹配。對(duì)照組包括高血壓人群（439 例）和血壓正常人群（554 例）。高血壓人群為同一醫(yī)院確診為高血壓的患者，病例組入選標(biāo)準(zhǔn)為通過(guò)CT 或MRI 確診為HS 的患者，排除因外傷或者其他原因引起的腦出血。HS 類型包括基底節(jié)區(qū)出血、腦葉出血、腦橋出血、小腦出血、腦室出血。本項(xiàng)研究通過(guò)了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并取得研究對(duì)象的知情同意。

人群和臨床資料收集包括年齡、性別、高血壓史、Ⅱ型糖尿病史、心血管疾病和腦卒中史等并檢測(cè)血壓，同時(shí)采集空腹靜脈血檢測(cè)血糖（glucose，GLU）、甘油三酯（triglycerides，TG）、膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

二、基因分型方法

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）的方法進(jìn)行基因分型。兩個(gè)位點(diǎn)的引物、識(shí)別的限制性內(nèi)切酶和酶切片段信息見(jiàn)表1。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板DNA 10 ng，引物各1 pmol，1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl，2 mmol/L dNTPs，0.5 U TaqDNA 聚合酶，總體積10 μL。酶切體系：5 μL PCR 產(chǎn)物，3.8 μL 水，2 U 限制性內(nèi)切酶，1 μL 10×buffer，37℃水浴12～16 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。rs12346650 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為110 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶AvaII 識(shí)別酶切片段分別為GG（87 bp+23 bp）、GA（110 bp+87 bp+23 bp）和AA 基因型（110 bp）；rs2505901 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為588 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BseLI 識(shí)別酶切片段分別為T(mén)T（322 bp+266 bp）、CT（588 bp+322 bp+266 bp）和CC 基因型（588 bp）。隨機(jī)抽取5%對(duì)象進(jìn)行重復(fù)基因分型，結(jié)果符合率達(dá)到99%以上。

表1 rs12346650 和rs2505901 位點(diǎn)PCR-RFLP 分析引物、限制性內(nèi)切酶及酶切片段大小

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Epidata3.1 雙重錄入電腦，經(jīng)比對(duì)無(wú)誤后進(jìn)一步整理，用軟件SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，2 組均數(shù)比較用成組t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用Fisher 精確概率法或χ2檢驗(yàn)。對(duì)rs12346650 和rs2505901 兩個(gè)基因位點(diǎn)分別按相加模型[CC，CT，TT（0，1，2）；GG，GA，AA（0，1，2）]、顯性模型[CC vs CT+TT（0，1）；GG vs GA+AA（0，1）]和隱性模型[CC+CT vs TT（0，1）；GG+GA vs AA（0，1）]進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)分析。應(yīng)用Logistic 回歸模型進(jìn)行多因素分析，校正年齡、性別、糖尿病史、高血壓病史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 因素，對(duì)性別進(jìn)行分層分析。以雙側(cè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

結(jié)果

一、病例組與對(duì)照組一般特征比較

病例組與對(duì)照組在Ⅱ型糖尿病史分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在年齡、性別、高血壓史、GLU、收縮壓、舒張壓、TC、TG、HDL-C、LDL-C 方面差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。因此，在分析rs12346650 和rs2505901 兩個(gè)位點(diǎn)變異與HS 關(guān)聯(lián)性時(shí)，調(diào)整上述指標(biāo)。

二、rs2505901、rs12346650多態(tài)性與HS關(guān)聯(lián)分析

總?cè)巳褐胁±M和對(duì)照組間rs2505901 和rs12346650 的基因型、等位基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），校正混雜因素年齡、性別、糖尿病史、高血壓史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 后，關(guān)聯(lián)仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 病例組和對(duì)照組人群的一般特征比較

三、按性別分層分析

進(jìn)一步按性別對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)與HS 的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分層分析，結(jié)果表明，男性人群中rs2505901 位點(diǎn)顯性模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比值比（odds ratio，OR）[95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.641（0.417～0.984），P=0.041。rs12346650 位點(diǎn)相加模型和隱性模型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR（95%CI）分別為1.369（1.020～1.836）、2.092（1.243～3.520），P 值分別為0.036、0.005。但校正年齡、糖尿病史、高血壓病史、TC、TG、HDL-C 和LDL-C 后，上述關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具體信息見(jiàn)表4。

在女性人群中，校正協(xié)變量前后rs2505901 位點(diǎn)與HS 均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。rs12346650 位點(diǎn)與HS 關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，校正協(xié)變量后的隱性模型OR（95%CI）為0.318（0.114～0.891），P=0.029。

表3 rs2505901、2346650 單核苷酸多態(tài)性與出血性腦卒中的關(guān)聯(lián)分析

表4 按性別分層分析結(jié)果

討論

TGFBR1 主要介導(dǎo)TGF-β 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)作用的信號(hào)，參與血管細(xì)胞外基質(zhì)沉淀和血管重塑。TGFBR基因多態(tài)性與多種疾病均存在關(guān)聯(lián)。已有研究表明TGFBR2 基因多態(tài)性與高年齡人群高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)增加顯著關(guān)聯(lián)，TGFBR1 基因多態(tài)性與賁門(mén)腺癌的發(fā)病密切相關(guān)，但是TGFBR1 基因多態(tài)性與腦卒中相關(guān)性的研究報(bào)道較少[10,11]。

本研究結(jié)果表明，在男性人群中，rs2505901 和rs12346650 兩個(gè)位點(diǎn)均和HS 存在弱的關(guān)聯(lián)，經(jīng)過(guò)校正混雜因素后，關(guān)聯(lián)未顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在女性人群中，校正混雜因素后rs12346650 位點(diǎn)與HS 存在關(guān)聯(lián)，其隱性模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR（95%CI）為0.318（0.114～0.891），提示rs12346650 位點(diǎn)A等位基因型的突變?cè)谂匀巳褐袑?duì)HS 可能具有保護(hù)性。

TGFBR1 定位在基因組9q22.33，包括9 個(gè)外顯子共5600 bp。成熟的TGFBR1 大約由500 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包括N-末端的胞外配體結(jié)合區(qū)域和C-末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性區(qū)域，在胞內(nèi)區(qū)域緊靠激酶活性區(qū)域的N 端側(cè)有一段高度保守的特異性SGSGSG 序列，稱為GS 區(qū)[12,13]。TGF-β1 不能和TGFBR1 直接作用，需要激活的TGFBR2 通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸化TGFBR1 的GS 區(qū)才能將其激活，受體復(fù)合物中TGFBR1 決定信號(hào)通路的性質(zhì)。在肝癌細(xì)胞株HLE 和HLF 的研究中發(fā)現(xiàn)，TGFBR1 激酶抑制劑LY2109761 通過(guò)兩種途徑減少腫瘤血管的形成從而限制肝癌的發(fā)生發(fā)展：（1）減少血管的數(shù)目和彎曲度，這兩者是腫瘤汲取氧氣和疏散藥物的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；（2）阻斷微環(huán)境中腫瘤與機(jī)體的相互作用[14]。上述研究表明TGFBR1 可以影響血管的發(fā)育和重塑。

miRNA 是指長(zhǎng)度約為21～25 個(gè)核苷酸，進(jìn)化保守、內(nèi)源性的非編碼小分子RNA。miRNA 在調(diào)控許多蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)方面起著非常重要的生物學(xué)作用，其與mRNA 不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)抑制翻譯的過(guò)程；而與mRNA 完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則切割或降解mRNA[15]。生物信息分析結(jié)果顯示，結(jié)合TGFBR1靶 基 因 的miRNA 只 有miR-938，miR-938 能 與TGFBR1 靶基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合從而抑制TGFBR1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控TGFBR1 基因的表達(dá)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-938 與心血管疾病的研究報(bào)道少見(jiàn)報(bào)道。

綜上所述，本研究考慮了高血壓作為HS 重要、獨(dú)立危險(xiǎn)因素對(duì)其發(fā)病的影響，同時(shí)還調(diào)整了年齡、性別、Ⅱ型糖尿病和血脂等因素的混雜作用，初步發(fā)現(xiàn)TGFBR1 基因rs12346650 及結(jié)合該基因的miR-938其基因rs2505901 多態(tài)性與HS 存在一定關(guān)聯(lián)，提示參與血管發(fā)育重塑的生物學(xué)分子通路遺傳變異可能參與了HS 發(fā)病的分子機(jī)制。有關(guān)研究結(jié)果將有待于其他人群研究進(jìn)一步驗(yàn)證。