江蕾微，董 仙，葉 藤，劉 志，李遠英，陸洪光

（貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

近年來隨著臨床醫(yī)療領(lǐng)域不斷進步，Apligraf VR、Dermagraft VR等各種組織工程皮膚均已在臨床創(chuàng)面修復(fù)工作中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)階段多以同種異體角質(zhì)形成細(xì)胞作為組織工程皮膚種子細(xì)胞[1]，但諸多因素提示其應(yīng)用效果欠佳，有研究認(rèn)為羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)作為種子細(xì)胞將有利于提高臨床組織工程皮膚應(yīng)用價值。hAECs具有向三個胚層分化可塑性[2]、表達生長因子（EGF、KGF、HGF）、抗炎和抗菌的細(xì)胞因子等優(yōu)勢，從而對促進創(chuàng)面愈合具有積極意義。hAECs相較于人類胚胎干細(xì)胞而言，由于前者未表達端粒酶，在對其移植時腫瘤形成風(fēng)險較低[2]，hAECs具有較低的免疫源性因此提示在對其移植后免疫排斥發(fā)生率較低。此外由于羊膜屬于產(chǎn)后廢棄物，因此取材簡單、易得性較優(yōu)、無倫理學(xué)爭議，利于臨床推廣。由上述可知，將hAECs應(yīng)用于組織工程皮膚再生工作中具有重要的研究價值?；诖?，本文將著重探討分離、培養(yǎng)、鑒定人羊膜上皮細(xì)胞的方法，以期為今后臨床開展相關(guān)工作提供有利參考依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（低糖型）（Gibco，USA），EGF（PeproTech，USA），胎牛血清（Hyclone，USA），Oct-3/4抗體（SantaCruz，USA），SSEA-4抗體（SantaCruz，USA），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，3111型），倒置生物顯微鏡（OLYMPUS，CK40-F200），熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus 公司），臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-40B型）。

1.2 羊膜來源

羊膜組織來源于貴州醫(yī)科大學(xué)產(chǎn)科，由健康足月產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)手術(shù)成功分娩新生兒后留存的新鮮胎盤，通過對胎盤羊膜組織機械剝離使其盡量保持完整。本次研究內(nèi)容通過本院醫(yī)學(xué)倫理研究會審核批準(zhǔn)，標(biāo)本取材前均征得本人同意且簽署相關(guān)協(xié)議（即醫(yī)院倫理委員會擬定的知情同意協(xié)議）。

1.3 hAECs分離培養(yǎng)

羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)提取方法為胰蛋白酶（低濃度）多步消化分離法,具體如下：①PBS對羊膜組織反復(fù)沖洗，之后剪為細(xì)碎小塊待用；②組織中加入EDTA溶液（內(nèi)含0.05%胰蛋白酶）并置入37℃環(huán)境下行10 min消化；③將消化液舍棄（即分離雜細(xì)胞、細(xì)胞碎片），重復(fù)消化30～40 min（條件同上）；④過濾（200目不銹鋼網(wǎng)）收集單細(xì)胞懸液，將其加入培養(yǎng)基（內(nèi)含10%FBS）終止消化；⑤再次過濾后重復(fù)消化1次（步驟同上）；⑥利用完全培養(yǎng)基（內(nèi)含10 ng/ml EGF）對離心收集細(xì)胞培養(yǎng)，即放置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)；⑦首次換液為24 h，之后每間隔3 d換液1次（全量），10 d左右細(xì)胞可根據(jù)常規(guī)方法實現(xiàn)傳代培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本文中計量、計數(shù)資料分別予以“±s”、n（%）形式體現(xiàn)，利用SPSS 26軟件檢驗相關(guān)數(shù)據(jù)（方法t/2），以P＜0.05提示對比結(jié)果存統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肉眼觀察

由健康足月產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)手術(shù)成功分娩新生兒后留存的新鮮胎盤剝離出厚度0.02～0.05 mm、透明、有韌性的羊膜組織。（見圖1）。

2.2 hAECs、KCs形態(tài)特征（原代培養(yǎng)）

原代hAECs接種24 h后可見多數(shù)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞剛貼壁時呈圓形、折光性強，之后其胞質(zhì)逐漸展開且折光性下降。3～5 d細(xì)胞貼壁進入指數(shù)生長期，此時可見細(xì)胞數(shù)量顯著增加、形態(tài)呈扁平多角形、核/漿比率較小的胞核則表現(xiàn)為圓形或卵圓形，6～8 d可見單層、細(xì)胞融合成片且表現(xiàn)出鋪路石樣，將其于顯微鏡下倒置觀察可見最初接種表皮細(xì)胞中存在較多KCs、少量黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，利用差別胰酶對其處理留存較純凈KCs。差別胰酶處理后所得第2代KCs可見細(xì)胞融合、表現(xiàn)為典型上皮細(xì)胞鋪路石樣、呈克隆狀生長，單個細(xì)胞具有清晰輪廓、呈圓形或多角形、折光性強。

2.3 hAECs來源特征（原代培養(yǎng)）

原代培養(yǎng)所得hAECs上皮細(xì)胞標(biāo)記物經(jīng)CKpan染色結(jié)果呈陽性，胞漿染色表現(xiàn)為棕褐色，蘇木精襯染胞核表現(xiàn)為藍紫色，提示培養(yǎng)所得細(xì)胞具有上皮特征。右圖為KCs陽性對照組。hAECs CK18染色（簡單原始上皮標(biāo)志物）呈陽性、胞漿染色呈棕褐色、蘇木精襯染胞核表現(xiàn)為藍紫色，已成熟表皮細(xì)胞KCs中可見CK18染色呈陰性。

3 討 論

實驗研究中發(fā)現(xiàn)，hAECs較易分離培養(yǎng)，hAECs經(jīng)過胰酶消化之后，原代細(xì)胞內(nèi)有羊膜間充質(zhì)細(xì)胞混雜其中，經(jīng)傳代培養(yǎng)后可實現(xiàn)逐漸純化，hAECs具有典型上皮樣形態(tài)（即鋪路石樣）。免疫組化可見hAECs廣譜角蛋白、CK18染色呈陽性，提示其存在具有上皮細(xì)胞特征及向上皮分化潛能。hAECs表達胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記物（即SSEA-4、OCT-4）,二者表達主要位于細(xì)胞高密度區(qū)、小克隆區(qū)、球體結(jié)構(gòu)區(qū)，因此較為稀疏的hAECs區(qū)域多無表達。上述結(jié)果與Miki,T.等人研究一致。羊膜屬于產(chǎn)后廢棄物從而取材簡單、無倫理學(xué)爭議，加之hAECs易于分離、體外大量擴增且具有干細(xì)胞的特性，因此提示其屬于較為理想的組織工程種子細(xì)胞之一。