李 楊 和銘鈺 吳長(zhǎng)玲 王中江 滕 飛

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院， 哈爾濱 150028)

0 引言

酶法制油是一種新型環(huán)保提油技術(shù)，可以從大豆中同步提取植物油及蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)提油技術(shù)相比，酶法制油具有處理?xiàng)l件溫和、產(chǎn)品品質(zhì)高、操作安全、環(huán)境污染小、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。隨著酶法制油技術(shù)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，其產(chǎn)生的大量加工副產(chǎn)物并未得到充分利用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，極大地影響了酶法制油技術(shù)的經(jīng)濟(jì)可行性[4-6]。目前，對(duì)豆渣的研究主要集中在多糖、膳食纖維、大豆異黃酮等方面，對(duì)豆渣蛋白的研究較少[7-9]。研究表明，與很多植物蛋白相類(lèi)似，豆渣蛋白中含人體所需的氨基酸，具有較低過(guò)敏性和較高的蛋白效價(jià)比。因此，酶法制油豆渣蛋白具有很大的發(fā)展?jié)摿10-11]。

空化射流技術(shù)是一種新型物理改性技術(shù)，該技術(shù)集高速?zèng)_擊、高頻振動(dòng)、高速剪切、超微粉碎、瞬時(shí)壓降等多種處理技術(shù)于一體，從而改變生物大分子物質(zhì)的物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性，并提高物質(zhì)功能活性。近幾年，有研究指出，空化射流處理對(duì)于改善蛋白結(jié)構(gòu)具有顯著功效[12-13]。文獻(xiàn)[14]研究了空化射流調(diào)節(jié)豌豆球蛋白可溶性聚集體的乳化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)微射流加工過(guò)程的空穴效應(yīng)導(dǎo)致球蛋白聚集體內(nèi)的結(jié)構(gòu)重排，從而提高了蛋白聚集體的乳液穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[15]研究表明，大豆分離蛋白(SPI)在空化射流高剪切處理下，導(dǎo)致大的不溶性聚集體破碎，并形成新的亞基間二硫鍵，從而大大提高了SPI的溶解度和表面疏水性。空化射流技術(shù)對(duì)植物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，與其他處理技術(shù)相比具有操作簡(jiǎn)單、處理時(shí)間短、溫度低和效果獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。目前，采用空化射流對(duì)SPI或其他豆類(lèi)分離蛋白改性的研究已經(jīng)很廣泛，但對(duì)豆渣蛋白的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文運(yùn)用空化射流技術(shù)處理酶法制油豆渣，采用二維及三維熒光光譜法、電泳及掃描電鏡分析不同時(shí)間空化射流處理下豆渣蛋白的構(gòu)象及表觀形態(tài)變化，通過(guò)豆渣蛋白界面性質(zhì)、溶解性、氨基酸水合能力、粒度分析及ζ-電位對(duì)其功能特性進(jìn)行表征，以明確空化射流對(duì)酶法制油豆渣蛋白的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)94%)，市售；堿性蛋白酶，酶活10 000 U/g以上，廣州柏棠貿(mào)易有限公司；Lowry法測(cè)溶解度試劑盒，上海荔達(dá)生物科技有限公司；大豆分離蛋白(純度90.21%以上，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.7%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.95%，粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.87%)，山東禹王實(shí)業(yè)(集團(tuán))有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S22-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂(lè)儀器有限公司；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PL303型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DC-500A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C型雷磁pH計(jì)，上海精科儀器有限公司；TDL-408型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9146型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；空化射流均質(zhì)機(jī)，北京中森匯嘉科技發(fā)展有限責(zé)任公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本HITACHI公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司。

1.3 方法

1.3.1酶法制油豆渣的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，將市售大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，取200 g過(guò)篩后的豆粉，按液料比6 mL/g加入蒸餾水，攪拌均勻后放入55℃水浴鍋內(nèi)按照酶法制油進(jìn)行酶解，酶解條件為：酶解溫度55℃、酶解時(shí)間2 h、pH值維持在9.0、堿性蛋白酶Protex6L(8 900 U/mL)添加量為0.5%，用攪拌器邊攪拌邊酶解，酶解結(jié)束后，取出并用1 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，之后在100℃沸水中滅酶5 min，滅酶后冷卻至室溫(20℃)，在4 500 r/min、4℃條件下離心20 min，離心后去除上層液體，僅保留下層豆渣，并在相同離心條件下按液料比3 mL/g用去離子水將豆渣水洗3遍，之后將豆渣在平板上鋪平后置入55℃鼓風(fēng)干燥箱待質(zhì)量恒定后取出研磨，即得所需酶法制油豆渣。

1.3.2空化射流技術(shù)處理

稱(chēng)取一定量研磨后的豆渣，按液料比8 mL/g溶于去離子水中，采用空化射流均質(zhì)機(jī)，對(duì)其進(jìn)行均質(zhì)處理，處理時(shí)間分別為5、10、15 min，同時(shí)以未經(jīng)過(guò)高壓微射流處理(0 min)的樣品作為對(duì)照，溫度25℃，壓力0.1 MPa，在4 500 r/min、4℃條件下離心20 min，之后沉淀干燥即可。

1.3.3基本成分測(cè)定

粗蛋白含量檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016，利用凱氏定氮法；可溶性蛋白含量測(cè)定參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1250—2006；膳食纖維含量檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.88—2014，利用重量法；脂肪含量檢測(cè)參照GB 5009.6—2016，利用索氏抽提法；含水率檢測(cè)參照GB 5009.3—2016，利用105℃ 恒重法；灰分含量檢測(cè)參照GB 5009.4—2016，利用灼燒恒重法。

1.3.4酶法制油豆渣蛋白等電點(diǎn)確定

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法采用沉淀質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定。取過(guò)100目篩的豆渣粉50 g，按液料比22 mL/g加入蒸餾水，45℃下用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至9.5，水浴鍋攪拌提取1 h，pH值維持9.5。在8 000 r/min、10 min、4℃條件下離心，去上清液平均分為10份，用1 mol/L HCl溶液分別調(diào)pH值至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0，靜置2 h后在4℃條件下8 000 r/min 離心10 min，棄去上清液后稱(chēng)質(zhì)量，重復(fù)一次，繪制沉淀量與pH值的關(guān)系曲線圖，沉淀量最大時(shí)的pH值為豆渣等電點(diǎn)，故等電點(diǎn)為4.6。

1.3.5豆渣蛋白的提取工藝

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，取100 g豆渣粉用正己烷以液料比6 mL/g混合攪拌1 h，離心(4 500 r/min、20 min、4℃)脫脂，得到脫脂豆粕[19]，將脫脂豆粕按1∶20的質(zhì)量比與水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，常溫?cái)嚢? h后，將其懸浮液在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液。再用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至豆渣等電點(diǎn)4.6。靜置2 h后在4℃條件下7 000 r/min離心30 min，得蛋白沉淀，用去離子水洗3次，最后取沉淀溶解于水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。再在4℃條件下9 000 r/min離心30 min，取上清液，將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀豆渣蛋白。

1.3.6乳化活性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

乳化性能的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，取一定體積質(zhì)量濃度為0.005 g/mL的蛋白質(zhì)溶液，加入同體積的葵花籽油，用高速分散器以10 000 r/min的速度高速攪拌1 min，之后分別在0 min和10 min從容器底部移取等分試樣的乳液(50 μL)，以質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的SDS(十二烷基硫酸鈉，pH值7.0)稀釋100倍，以SDS溶液為空白，在500 nm下測(cè)量稀釋溶液的吸光度，乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計(jì)算公式為

(1)

(2)

式中A0——初始時(shí)刻的吸光度

N——稀釋倍數(shù)，取100

C——豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

V——乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，%

ΔT——時(shí)間差，min

ΔA——ΔT內(nèi)的吸光度差

A10——10 min時(shí)吸光度

1.3.7起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[21]的發(fā)泡性能測(cè)定方法，取50 mL質(zhì)量濃度0.03 g/mL豆渣蛋白溶液用高速分散器以10 000 r/min的速度攪打1 min，用10 mL蒸餾水清洗刀具，洗液小心并入起泡液中，記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品靜置10、20、30 min，記錄不同時(shí)間段的泡沫體積，其中所有實(shí)驗(yàn)平均測(cè)量3次。起泡性指數(shù)(FC)和泡沫穩(wěn)定性指數(shù)(FS)計(jì)算公式為

(3)

(4)

式中V1——攪打前體積，mL

V2——攪打后體積，mL

V3——放置一段時(shí)間后泡沫體積，mL

1.3.8溶解性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]的方法并加以改進(jìn)。將豆渣蛋白溶于去離子水中，分別配成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04 g/mL的豆渣蛋白溶液。精確稱(chēng)取10 mL豆渣蛋白溶液，在4 500g條件下離心15 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，應(yīng)用Lowry法測(cè)定上清液蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用凱氏定氮法測(cè)定樣品總蛋白含量。溶解度S計(jì)算公式為

式中T1——上清液豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

T2——總豆渣蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

1.3.9氨基酸分析

根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]的測(cè)定方法，利用L-8800型氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸分析。

1.3.10粒徑分布及ζ-電位測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[25]的測(cè)定方法，利用Mastersizer 2000型激光粒度儀進(jìn)行粒徑分布及ζ-電位測(cè)定。

1.3.11熒光光譜分析

根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]的測(cè)定方法，使用F-4500型熒光光譜儀測(cè)定樣品的熒光光譜。配置50 mL質(zhì)量濃度10 mg/mL的豆渣蛋白溶液，用磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后取適量稀釋樣品置于石英比色皿中測(cè)定。二維熒光測(cè)定參數(shù)為：掃描發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm；三維熒光光譜的連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長(zhǎng)為200～500 nm，起始激發(fā)波長(zhǎng)為200 nm，增長(zhǎng)間隔為10 nm，掃描16條曲線。

1.3.12掃描電子顯微鏡觀察

參照文獻(xiàn)[28]的方法并略作修改。稱(chēng)取0.1 g樣品，將其固定在碳帶和鋁短柱上并在真空下涂覆鉑-鉛(Pt-Pb)，于3 kV下觀察豆渣蛋白微觀結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.13十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參照文獻(xiàn)[29]的方法，并稍作修改。將SPI溶液以質(zhì)量濃度1.5 mg/mL懸浮在磷酸鹽緩沖液(0.02 mmol/L，pH值 6.0)中。將SPI溶液(1 mL)加入4 mL樣品緩沖液中，煮5 min。將Bio-RadMiniProtean3系統(tǒng)用作不連續(xù)的緩沖液系統(tǒng)，在5%堆積凝膠和12%分離凝膠上，恒定電流設(shè)置為25 mA，持續(xù)約1.5 h。蛋白帶用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，然后用7%的乙酸(甲醇、乙酸、水體積比227∶37∶236)脫色。將預(yù)先染色的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記(10～170 ku)在同一凝膠上電泳，以鑒定染色的凝膠中蛋白質(zhì)條帶的分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

在本研究中，所有收集的數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值及3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，利用SPSS Statistics 22軟件，采用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，p<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣基本成分分析

由表1可知，豆渣中主要成分是膳食纖維，其次就是蛋白質(zhì)。未處理及空化射流處理(5、10、15 min)的豆渣蛋白水溶性蛋白質(zhì)量占粗蛋白百分比分別為71.63%、73.21%、74.59%及74%。與未處理豆渣蛋白相比，水溶性蛋白含量顯著提高，表明空化射流處理可以使豆渣蛋白中的不溶性成分轉(zhuǎn)為可溶。

表1 豆渣基本成分含量Tab.1 Composition of soybean residue protein %

2.2 豆渣蛋白粒徑及ζ-電位分析

圖1(圖中相同圖例不同字母表示處理間差異顯著，下同)為不同空化射流處理時(shí)間對(duì)豆渣蛋白粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]及ζ-電位的影響。與未處理豆渣蛋白相比，經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白溶液顯示出更寬的顆粒分布，體積平均粒徑D[4,3]較低，ζ-電位絕對(duì)值升高，表明空化射流處理使豆渣蛋白溶液體系更加穩(wěn)定。當(dāng)空化微射流處理10 min后，D[4，3]最低，為(470.10±8.70)nm，ζ-電位絕對(duì)值最高，為(27.4±0.83)mV。另外，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣蛋白粒徑先降低后升高，ζ-電位絕對(duì)值先增加后降低。原因是空化射流處理過(guò)程中的強(qiáng)力剪切、高速?zèng)_擊及高頻振動(dòng)等作用能有效減小豆渣蛋白的粒徑，增加蛋白質(zhì)上的負(fù)表面電荷，增強(qiáng)顆粒間靜電排斥，破壞現(xiàn)有蛋白質(zhì)聚集體，并抑制進(jìn)一步聚集，粒子間的相互排斥力增大，體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)度的處理在一定程度上促使蛋白分子間發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)變性，高頻的聚集現(xiàn)象和極高的能量密度使豆渣蛋白產(chǎn)生了過(guò)處理現(xiàn)象，使豆渣蛋白發(fā)生熱聚集，故粒徑變大，ζ-電位絕對(duì)值降低，體系穩(wěn)定性下降[30]。

圖1 不同空化射流處理時(shí)間對(duì)豆渣蛋白粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]及ζ-電位的影響Fig.1 Effects of different cavitation jet treatment times on particle size distribution and volume mean diameter D[4,3] and ζ-potential of soybean residue protein

2.3 豆渣蛋白微觀結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)掃描電子顯微鏡可以更好地觀察豆渣蛋白表觀結(jié)構(gòu)的顯著變化。由圖2a、2c可以看出，未處理的豆渣蛋白呈聚集狀態(tài)，且形狀不規(guī)則，大小不均一。當(dāng)經(jīng)過(guò)10 min的空化射流處理后發(fā)現(xiàn)，豆渣蛋白的尺寸變小，質(zhì)地也更松散，表明空化射流處理使豆渣蛋白部分展開(kāi)，使聚集狀態(tài)的豆渣蛋白分散。

圖2 豆渣蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy of soybean residue protein

2.4 豆渣蛋白溶解性分析

由于溶解度是蛋白質(zhì)變性和聚集最實(shí)用的衡量指標(biāo)，因此它是蛋白質(zhì)功能的良好指標(biāo)，溶解度的改變可以改善豆渣蛋白的功能特性[31]。不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的溶解度變化如圖3所示，對(duì)比發(fā)現(xiàn)在同一蛋白質(zhì)量濃度下空化射流處理后豆渣蛋白溶解度均有所提升，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，溶解度呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。這主要是因?yàn)?，空化射流處理產(chǎn)生的空穴效應(yīng)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生解折疊，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，親水性提高，疏水基團(tuán)暴露；另一方面，空化射流的剪切作用使豆渣蛋白粒徑減小，蛋白比表面積增加，增加了蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用，豆渣蛋白溶解性得到改善[32-33]。但隨著處理的繼續(xù)進(jìn)行，分子碰撞作用不再增加，蛋白質(zhì)部分變性，可溶性聚集體變?yōu)椴蝗苄猿恋?，?dǎo)致豆渣蛋白溶解度降低。文獻(xiàn)[34]研究發(fā)現(xiàn)，在較短的處理時(shí)間內(nèi)，旋轉(zhuǎn)空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊和構(gòu)象變化，最初不溶的沉淀物形成可溶性聚集體，提高了商業(yè)SPI的溶解度，從而驗(yàn)證了本研究的結(jié)果。

圖3 不同空化射流處理時(shí)間對(duì)豆渣蛋白溶液溶解度的影響Fig.3 Effect of different cavitation jet treatment times on solubility of soybean residue protein solution

2.5 豆渣蛋白界面性質(zhì)分析

圖4為不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的界面性質(zhì)。結(jié)果表明，空化射流可以顯著改善豆渣蛋白的起泡性和乳化性(p<0.05)。隨著空化射流時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣蛋白的起泡性和乳化性均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，處理時(shí)間10 min最佳。

圖4 不同空化射流處理時(shí)間對(duì)豆渣蛋白界面性質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different cavitation jet treatment times on interfacial properties of soybean residue protein

泡沫形成受3個(gè)因素影響：分子在空氣-水界面的轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透和重組。因此，要表現(xiàn)出良好的發(fā)泡性，蛋白質(zhì)必須能夠在空氣-水界面遷移，在界面處展開(kāi)和重新排列[33]。文獻(xiàn)[35]研究表明，更大的溶解度有利于在界面處形成多層粘性蛋白膜，以提高泡沫的容量和穩(wěn)定性?？栈淞髯饔檬沟鞍踪|(zhì)展開(kāi)，遷移至空氣-水界面的蛋白分子數(shù)量增多，溶解性增強(qiáng)，分子交聯(lián)程度增加，蛋白質(zhì)分子變得更加柔軟，促進(jìn)了泡沫的形成，從而增加了豆渣蛋白的發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性。

乳化性的增加是因?yàn)槎乖鞍自诳栈淞骺栈图羟凶饔孟?，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞從而使肽鏈得到進(jìn)一步伸展，疏水基團(tuán)朝向油相形成液膜來(lái)固定油滴，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在水-油界面上的更有效吸收。但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白分子間重新形成難溶性分子聚集體，分子間碰撞停止，無(wú)法達(dá)到良好的親水-疏水平衡，導(dǎo)致起泡性和乳化性降低[36-38]。FC、FS、EAI及ESI隨空化射流時(shí)間的變化與溶解度的變化一致，這證實(shí)溶解度的增加有助于乳化能力和起泡性的提高。

2.6 豆渣蛋白氨基酸分析

表2為SPI、未處理及經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白氨基酸組成分析。結(jié)果表明豆渣蛋白與SPI的氨基酸組成相似，其主要組成均為谷氨酸。豆渣蛋白中人體必需氨基酸含量高于SPI，且經(jīng)空化射流處理后含量增加(SPI、未處理及空化射流處理下豆渣蛋白的必需氨基酸含量分別為20.88%、21.64%及25%)，故豆渣蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。水合能力α(g/g)的計(jì)算公式為

α=fC+0.4fF+0.2fN

(5)

式中fC、fF、fN——蛋白質(zhì)分子中帶電、極性和非極性殘基所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 氨基酸分析Tab.2 Amino acid (AA) analysis %

如表2所示，SPI、未處理及空化射流處理下豆渣蛋白的疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為29.17%、30.26%及33.03%，豆渣蛋白所含疏水性氨基酸含量高于SPI。經(jīng)計(jì)算，SPI的α為0.82 g/g，而未處理及經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白α分別為0.75、0.77 g/g。可以得出豆渣蛋白結(jié)合水能力低于SPI，且空化射流處理的豆渣蛋白水合能力比未處理的高，與上述豆渣蛋白溶解度變化趨勢(shì)一致。

2.7 豆渣蛋白SDS-PAGE分析

樣品的SDS-PAGE譜圖如圖5所示，其中A、B、 C分別表示未處理豆渣蛋白、空化射流處理10 min的豆渣蛋白和SPI，M表示蛋白質(zhì)marker。豆渣蛋白與SPI的組成類(lèi)似，主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)組成。7S是3種亞基通過(guò)非共價(jià)鍵的結(jié)合，即α′、α和β，而11S是由6個(gè)亞基組成，酸性(A)和堿性(B)亞基經(jīng)過(guò)一個(gè)二硫鍵連接為AB亞基。與未處理的豆渣蛋白(圖5中A)相比，空化射流處理10 min后，α′、α強(qiáng)度降低，分子質(zhì)量由高向低轉(zhuǎn)移。這表明空化射流處理破壞了氫鍵和疏水鍵，導(dǎo)致分子質(zhì)量改變和降低，進(jìn)而增加蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用，氨基酸內(nèi)部親水基團(tuán)暴露于水中，進(jìn)而豆渣蛋白的溶解度提高[39]。

圖5 豆渣蛋白的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE image of soybean residue protein

2.8 豆渣蛋白二維熒光光譜分析

大豆蛋白的熒光主要來(lái)自于Trp殘基，且其熒光變化值可直接反映大豆蛋白中Trp殘基本身及其周?chē)h(huán)境變化，因此可以從熒光的波動(dòng)確定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。研究表明最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)λmax與Trp殘基所處的微環(huán)境有關(guān)，λmax小于330 nm表示Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中，當(dāng)λmax大于330 nm時(shí)表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[27，40]。如圖6所示，空化射流處理0～15 min的豆渣蛋白λmax分別為342.6、344、350.8、346.6 nm，由此可知本研究所測(cè)試豆渣蛋白Trp殘基分布趨向于蛋白分子外部環(huán)境。與未處理豆渣蛋白相比，空化射流處理的豆渣蛋白發(fā)生了紅移，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紅移遷移量先增加后降低。并且當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。這種結(jié)果主要?dú)w因于空化射流使豆渣蛋白的空間構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)展開(kāi)，最初掩埋在分子內(nèi)部疏水環(huán)境的Trp殘基逐漸暴露在外部的親水環(huán)境中，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[41-42]，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度改變和位移。但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開(kāi)，蛋白分子間的次級(jí)鍵和疏水作用等使蛋白發(fā)生聚集，生色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中，使熒光強(qiáng)度下降，λmax藍(lán)移。

圖7 豆渣蛋白體系三維熒光強(qiáng)度等高線圖Fig.7 3D-contour line figures of soybean residue protein

圖6 不同空化射流處理時(shí)間豆渣蛋白的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of soybean residue protein at different cavitation jet treatment times

2.9 豆渣蛋白三維熒光光譜分析

三維熒光光譜法是一種用于提供蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)信息的有力方法。圖7為不同空化射流處理時(shí)間下豆渣蛋白的三維熒光光譜圖，并繪出相應(yīng)的強(qiáng)度等高線圖。其中兩個(gè)形如山脊的小峰為瑞利一級(jí)散射峰Peak a(λex=λem，λex表示激發(fā)波長(zhǎng)，λem表示發(fā)射波長(zhǎng))及二級(jí)散射峰Peak b(2λex=λem)；Peak 1為蛋白質(zhì)Trp和Tyr殘基的特征峰(λex=280 nm，λem= 340 nm)；Peak 2主要代表多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰(λex= 230 nm，λem= 350 nm)，這些都是熒光峰的典型特征峰[43]。

通過(guò)對(duì)比可知，經(jīng)空化射流處理的豆渣蛋白瑞利一級(jí)散射峰Peak a熒光強(qiáng)度顯著高于未處理豆渣蛋白(p<0.05)，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣蛋白的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是空化射流作用帶來(lái)的分子碰撞使豆渣蛋白形成部分大粒徑的可溶性聚集體，光散射作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的瑞利衍射峰。當(dāng)作用時(shí)間超過(guò)10 min后，這種分子碰撞停止，故熒光強(qiáng)度反而下降[44]。

熒光特征峰Peak 1及 Peak 2主要顯示了Trp殘基和Tyr殘基的光譜特性。未處理及不同空化射流處理時(shí)間(5、10、15 min)的豆渣蛋白的熒光特征峰Peak 1強(qiáng)度分別為189.6、225、278.8及218.3。顯然，經(jīng)過(guò)空化射流處理后熒光特征峰Peak 1強(qiáng)度高于未處理，這主要是由于空化射流處理使蛋白質(zhì)分子伸展，粒徑減小導(dǎo)致其疏水結(jié)合及離子結(jié)合被切斷，非極性基團(tuán)暴露，Trp和Tyr趨向暴露態(tài)， 氫鍵作用逐漸減小，故熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)變化；而當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到10 min后，豆渣蛋白分子間碰撞作用停止，氫鍵作用反而增大，豆渣蛋白部分變性，蛋白發(fā)生聚集，形成不溶性聚集體，使熒光強(qiáng)度下降。

另外對(duì)比熒光特征峰Peak 2，未處理及不同空化射流空化射流處理時(shí)間(5、10、15 min)的豆渣蛋白的熒光特征峰Peak 2強(qiáng)度分別為99.53、118.9、107.3及106.2。表明空化射流作用使熒光特征峰Peak 2的區(qū)域面積發(fā)生變化，豆渣蛋白多肽鏈的骨架伸展，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)逐漸暴露。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光特征峰Peak 2強(qiáng)度有所降低，表明豆渣蛋白分子間作用降低，促使暴露態(tài)疏水性氨基酸重新包埋在分子內(nèi)部[45-46]。但空化射流作用并未顯著改變豆渣蛋白的酪氨酸特征峰熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)對(duì)比不同空化射流處理時(shí)間下酶法制油豆渣蛋白的氨基酸組成、粒徑、ζ-電位、溶解性、界面性質(zhì)及二維和三維熒光光譜，發(fā)現(xiàn)空化射流作用時(shí)間為10 min時(shí)，效果較好。隨著空化射流處理時(shí)間的延長(zhǎng)，豆渣蛋白的粒徑分布、體積平均粒徑D[4,3]先降低后升高、ζ-電位絕對(duì)值先升高后降低，空化射流處理后，豆渣蛋白溶解性、起泡性及乳化性均有所改善。經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，酶法制油豆渣蛋白和SPI的氨基酸組成相似，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且豆渣蛋白所含人體必需氨基酸及疏水性氨基酸含量均高于SPI。熒光光譜的變化表明，空化射流導(dǎo)致豆渣蛋白構(gòu)象改變，色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，最初掩埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露。因此，空化射流技術(shù)可以有效改善酶法制油豆渣蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特性，本研究可為空化射流技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域提供理論指導(dǎo)。