（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

死亡時間或死后間隔時間（postmortem interval，PMI）是指機體死后所經(jīng)歷的時間間隔[1]。早期死亡時間推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點問題，對于認定案件事實、確定犯案時間、排查犯罪嫌疑人以及劃定偵查范圍有著重要的意義。在法醫(yī)學(xué)實踐中，死亡時間推斷主要依靠尸體現(xiàn)象，如尸溫、尸僵、尸斑、角膜變化、超生反應(yīng)等，這些方法簡單實用，但主觀性較強，結(jié)果差異大，因此，有學(xué)者[2]認為不應(yīng)將這類推斷結(jié)果作為法庭證據(jù)使用。其他例如物理方法、組織生物化學(xué)方法、DNA和RNA降解相關(guān)研究及代謝組學(xué)方法均已有報道[3-5]。在死亡時間推斷的研究中，環(huán)境溫度是重要的影響因素之一，無論是傳統(tǒng)方法還是新技術(shù)，均會影響推斷結(jié)果的準確性[6-7]。YANG等[8]為了考察環(huán)境溫度的影響，通過測量玻璃體液中鉀、鈉、氯等離子及腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、肌酐和尿素氮的濃度，結(jié)合環(huán)境溫度，建立了物質(zhì)濃度、環(huán)境溫度、死亡時間三者相互關(guān)系的插值函數(shù)模型，用于不同環(huán)境溫度下的死亡時間推斷。

代謝組學(xué)是一種對體內(nèi)小分子代謝物（相對分子質(zhì)量<1 000）進行整體分析的方法，通過系統(tǒng)觀察小分子代謝物整體變化情況可以推斷死亡時間，而與氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合是常用的技術(shù)手段。雖然該方法需要對樣品進行衍生化處理[9]，但由于該方法分辨率高、靈敏度好、選擇性好、分析時間短以及擁有諸如美國國家標準與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）數(shù)據(jù)庫等優(yōu)勢，被許多相關(guān)的研究所采用。近年來，已有許多利用代謝組學(xué)手段推斷死亡時間的研究[10-12]，其中部分學(xué)者[13-15]基于GCMS代謝組學(xué)進行大鼠窒息死以及中毒死的死亡時間推斷研究，并建立了死亡時間推斷的代謝組學(xué)模型。然而，這些利用代謝組學(xué)推斷死亡時間的研究均將外界環(huán)境溫度設(shè)定在一個恒定狀態(tài)，并未探討不同環(huán)境溫度下的死亡時間推斷情況。

本研究旨在通過GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)觀察不同環(huán)境溫度（5℃、15℃、25℃、35℃）下機體死后內(nèi)源性小分子物質(zhì)的整體變化情況，結(jié)合多元統(tǒng)計分析篩選各環(huán)境溫度下大鼠機體內(nèi)與死亡時間相關(guān)的差異代謝物，并利用這些差異代謝物分別建立不同環(huán)境溫度條件下大鼠的早期死亡時間（0～24h）推斷模型，對大鼠早期死亡時間進行推斷。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），Sorvall ST16R高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），DC-24-RT防腐型氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司），CTHI-250B恒溫恒濕箱［施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司］。

L-2-氯苯丙氨酸（純度99%）、甲氧胺鹽酸鹽（純度98%）均購自北京百靈威科技有限公司，硬脂酸甲酯（純度99.5%，美國Sigma-Aldrich公司），N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺［N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA］+1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）25 mL（北京索萊寶科技有限公司），乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司），吡啶（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司），正庚烷（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）。

1.2 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠132只，體質(zhì)量（220±10）g，購自成都達碩實驗動物有限公司。本研究獲得四川大學(xué)動物倫理學(xué)委員會批準。

大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±2）℃，相對濕度45%～55%，光照/黑暗 12 h 交替（08：00—20：00/20：00—08：00），自由飲水進食。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周。

1.2.1 實驗組

將96只大鼠隨機分為5℃、15℃、25℃、35℃組，每組均設(shè)置死后3 h、6 h、12 h、24 h共4個時間點，每個時間點6只，所有大鼠在處死后立即被放入設(shè)置好溫度的培養(yǎng)箱中。

大鼠的處死方式均為：用尼龍繩打一個可活動的結(jié)扣，乙醚麻醉大鼠后，將其頸部置于結(jié)扣內(nèi)，拉動結(jié)扣使其慢慢收緊，造成頸部氣管受壓從而引起窒息死亡。在預(yù)先設(shè)定的時間點解剖大鼠并采集心血約0.5 mL，迅速將血液樣本置于液氮中冷凍后于-80℃儲存。

1.2.2 對照組

取6只大鼠，于處死后立即（死后0 h）解剖并取樣，作為對照組。其余處理方法同實驗組。

1.2.3 預(yù)測組

另取30只大鼠作為預(yù)測組。首先將其中24只大鼠分為5℃、15℃、25℃、35℃組，每組設(shè)置死后9 h、18h兩個時間點，每個時間點3只。另外6只大鼠：3只的死后環(huán)境溫度設(shè)置為10℃，于死后12 h取樣；3只的死后環(huán)境溫度設(shè)置為20℃，于死后6h取樣。其余處理方法同實驗組。

1.3 樣本前處理

血液樣本：在已有文獻[16]的基礎(chǔ)上進行改進，將血液樣本置于4℃冰箱中解凍，解凍后將樣本混勻。取100μL血液樣本于1.5mL微量離心管中，加入250μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL，混勻。加入-20℃冰乙腈300μL，渦旋混勻15s后于冷凍離心機中在4℃下以16099×g離心10min，取上清液100μL于另一微量離心管中，室溫下氮氣流揮干。殘渣中加入30μL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的甲氧胺吡啶溶液，密閉渦旋15s，置于80℃烘箱中肟化15min，取出后于暗處放置冷卻30min。肟化完成后，迅速加入30μL硅烷化試劑（BSTFA+1%TMCS），渦旋15s，于80℃烘箱中衍生化15min，取出后暗處放置30min冷卻。衍生化完成后，加入50μL質(zhì)量濃度為50μg/mL的硬脂酸甲酯庚烷溶液，渦旋15 s。冷凍離心機中4℃下以16 099×g離心10min后取上清液90μL置于裝有支架的液相小瓶中進行GC-MS分析。

空白樣本：取100 μL冰乙腈于1.5 mL微量離心管中，加入250 μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液20μL，其余操作同血液樣本。

質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本：取各溫度組內(nèi)的所有血液樣本各30μL于2.5mL微量離心管中混勻，分別制得4個溫度組的QC樣本。取100 μL QC樣本于1.5mL微量離心管中，加入250μg/mL的L-2-氯苯丙氨酸溶液20μL，混勻，加入300μL冰乙腈，其余操作同血液樣本。

1.4 GC-MS分析

1.4.1 分析條件

色譜條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為250℃，輔助加熱器溫度為230℃，分流比為5∶1；起始溫度為60℃，保持1 min，以8℃/min升至300℃，最后保持7min。

質(zhì)譜條件：四極桿溫度設(shè)置為150℃，離子源溫度設(shè)置為230℃，采用電子轟擊電離（electron impact ionization，EI）方式，電離能量為 70 eV，溶劑延遲為4.5min，設(shè)置為全掃描模式，掃描范圍m/z 50～600。

1.4.2 進樣條件和方式

檢測血液樣本前先進行1個硬脂酸甲酯庚烷溶液樣本、1個空白樣本以及3個QC樣本進樣，而后每8個血液樣本間安插1個QC樣本（每個溫度組樣本分析過程均進了6個QC樣本）。硬脂酸甲酯用于觀察各色譜峰的位置是否有較大偏移，空白樣本用于排除外源性物質(zhì)的干擾，QC樣本用于監(jiān)測整個分析過程的穩(wěn)定性，并評估方法的再現(xiàn)性和穩(wěn)定性[17-18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 預(yù)處理

整理包含樣本信息、保留時間和峰面積的數(shù)據(jù)。（1）所有樣本均扣除空白樣本中出現(xiàn)的污染物色譜峰。（2）所有剩余的代謝物通過匹配NIST 14譜庫，按匹配度>80%的標準進行匹配確定。（3）將所有代謝物峰面積除以L-2-氯苯丙氨酸峰面積進行校正，得到所有代謝物的相對含量。（4）計算各代謝物在QC樣本上的相對標準差（relative standard deviation，RSD），當RSD>30%時[19]，將該代謝物數(shù)據(jù)作為異常值剔除。將預(yù)處理好的數(shù)據(jù)制作成Excel數(shù)據(jù)矩陣。

1.5.2 統(tǒng)計分析

將分組后的數(shù)據(jù)制成矩陣形式分別導(dǎo)入SIMCAP 14.1軟件（瑞典Umetrics公司），對數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及正交偏最小二乘（orthogonal partial least square，OPLS）分析，得到的得分圖是PCA以及OPLS分析的可視化結(jié)果。PCA用于觀察分析過程是否穩(wěn)定，OPLS分析用于差異代謝物的篩選及回歸模型的建立，并采用交叉驗證和置換驗證來驗證模型的可靠性。參考以往研究[15]，將本實驗差異代謝物的篩選標準設(shè)定為：OPLS分析中變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1，SPSS 22.0軟件（美國IBM公司）中Kruskal-Wallis檢驗P<0.001。利用篩選出的差異代謝物建立OPLS回歸模型用于死亡時間推斷，該回歸模型中的自變量（x）為差異代謝物相對含量的整體變化，因變量（y）為死亡時間。

模型對于預(yù)測組的預(yù)測結(jié)果與實際死亡時間之間的比較用均方根誤差（root mean square error，RMSE）表示，代表預(yù)測值與真實值之間的偏差，可用于比較不同模型之間的預(yù)測能力。同時，為了考察環(huán)境溫度對于推斷偏差的影響，采用t檢驗分別對5℃模型預(yù)測其他溫度（15℃、25℃、35℃）預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差進行比較，檢驗水準α=0.05。

將4個溫度組共同差異代謝物的信息導(dǎo)入GraphPad Prism 6.0軟件（美國GraphPad Software公司）制作其相對含量變化趨勢圖，用于觀察變化趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 代謝產(chǎn)物的鑒定

4個溫度組的血液樣本經(jīng)GC-MS分析后得到的全代謝物為：5℃組67種，15℃組68種，25℃組72種，35℃組78種。這些物質(zhì)包括有機酸、氨基酸、糖類、脂質(zhì)以及部分其他代謝物等。

2.2 多元統(tǒng)計分析

2.2.1 PCA分析

PCA分析結(jié)果如圖1所示，各組的QC樣本聚集在一起，說明GC-MS本身以及樣本在進樣前、進樣中和進樣后都保持相對穩(wěn)定，通過該儀器獲得的數(shù)據(jù)也穩(wěn)定可靠。

圖1 4個溫度組樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plots of samples in 4 temperature groups

2.2.2 OPLS分析篩選差異代謝物

OPLS分析篩選出各溫度組大鼠血液代謝物中與死亡時間相關(guān)的差異代謝物。5℃組共有18種差異代謝物，其中有機酸3種（琥珀酸、?；撬帷?-羥基丁酸），氨基酸5種（賴氨酸、丙氨酸、5-羥脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸），糖類1種（山梨糖醇），脂質(zhì)2種（磷酸甘油、甘油）以及其他類物質(zhì)7種（黃嘌呤、丙二醇、丙胺、肌醇、次黃嘌呤、煙酰胺、胸腺嘧啶）。15℃組共有15種差異代謝物，其中有機酸1種（泛酸），氨基酸4種（異亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸），脂質(zhì)4種（甘油、花生四烯酸、磷酸甘油、花生酸）以及其他類物質(zhì)6種（黃嘌呤、乙醇胺、丙二醇、腺嘌呤、次黃嘌呤、尿酸）。25℃組共有24種差異代謝物，其中有機酸3種（泛酸、琥珀酸、4-羥基丁酸），氨基酸8種（酪氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、氨基丙二酸、丙氨酸），糖類2種（山梨糖醇、甘露糖），脂質(zhì)4種（二十二碳四烯酸、甘油、磷酸甘油、膽固醇）以及其他類物質(zhì)7種（黃嘌呤、胸腺嘧啶、乙醇胺、尿嘧啶、尿酸、次黃嘌呤、煙酰胺）。35℃組共有30種差異代謝物，其中有機酸4種（泛酸、琥珀酸、4-羥基丁酸、丙酮酸），氨基酸12種（異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸），糖類2種（山梨糖、甘露糖），脂質(zhì)3種（膽固醇、甘油、磷酸甘油）以及其他類物質(zhì)9種（胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤、丙二醇、次黃嘌呤、乙醇胺、腺嘌呤、多巴胺、肌醇）。其中，黃嘌呤、次黃嘌呤、甘油、磷酸甘油、丙氨酸以及異亮氨酸為4個溫度組所共有的差異代謝物，這6種物質(zhì)的相對含量隨死亡時間的變化趨勢見圖2。

圖2 4個溫度組共有差異代謝物隨死亡時間的變化Fig.2 Changes of common differential metabolites with postmortem interval in 4 temperature groups

2.2.3 OPLS回歸模型及模型驗證

利用差異代謝物建立的OPLS得分圖見圖3。從圖中可見，5℃組大鼠死后3h與6h的分離度較差，其余各組各死亡時間點之間基本分離。在各溫度組模型中，死后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h的樣本在圖中分布大致為從左到右的順序，表明分布位置與死亡時間具有一定的相關(guān)性。

圖3 4個溫度組樣本的OPLS得分圖Fig.3 OPLS score plots of samples in 4 temperature groups

利用差異代謝物建立各溫度組的OPLS回歸模型方程，分別為：5 ℃，y=x+3.893×10-7（R2=0.915 4）；15℃，y=x-3.623×10-7（R2=0.8943）；25℃，y=x+3.149×10-7（R2=0.974 0）；35℃：y=x-5.639×10-7（R2=0.992 1）?？梢姴町惔x物的整體變化與死亡時間之間具有一定的線性相關(guān)。

4個溫度組OPLS回歸模型的交叉驗證以及置換驗證結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各溫度組模型的擬合程度和預(yù)測能力均較好，未出現(xiàn)過擬合的情況。

表1 4個溫度組OPLS回歸模型的交叉驗證及置換驗證結(jié)果Tab.1 Cross validation and permutation validation results of OPLS regression models in 4 temperature groups

2.3 OPLS回歸模型用于預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果

首先將24只預(yù)測組大鼠樣本數(shù)據(jù)分別代入所建立的5℃、15℃、25℃、35℃組模型中，然后將環(huán)境溫度為10℃、20℃的預(yù)測組樣本分別代入與其溫度最接近的模型中進行預(yù)測，即分別代入5℃組和15℃組模型進行預(yù)測，預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，5℃模型相對其他組預(yù)測偏差較大，其余各組預(yù)測結(jié)果較為理想。

表2 預(yù)測組樣本的預(yù)測結(jié)果Tab.2 Prediction results of samples in prediction groups（n=3，時間/h）

為了探究溫度造成的偏差與組內(nèi)偏差之間的關(guān)系，將15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本均代入5℃模型中進行預(yù)測，采用t檢驗分別對5℃模型預(yù)測15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差進行比較，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，利用5℃組模型預(yù)測其他溫度預(yù)測組樣本的偏差與5℃預(yù)測組樣本的偏差之間，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表3 5℃模型對不同溫度預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差比較Tab.3 Error comparison of prediction results of different temperature prediction groups using 5℃model（n=3，時間/h）

3 討 論

本研究基于GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析，分別篩選出5℃、15℃、25℃、35℃環(huán)境溫度下窒息死大鼠心血中與死亡時間相關(guān)的差異代謝物，并利用這些差異代謝物建立了4種環(huán)境溫度下的OPLS回歸模型用于推斷窒息死大鼠的早期死亡時間，同時設(shè)置了預(yù)測組樣本考察各溫度組模型的預(yù)測能力。與以往利用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)推斷死亡時間的研究[13-15，20]相比，本研究對環(huán)境溫度進行了細化和分組，一定程度上提高了代謝組學(xué)推斷死亡時間的準確性。在模型建立過程中，PCA分析用于觀察整個過程是否穩(wěn)定，結(jié)果顯示，各組QC樣本在PCA得分圖中均聚集，說明整個分析過程穩(wěn)定、可靠[14-15]，排除了儀器等不穩(wěn)定因素對數(shù)據(jù)造成的干擾。OPLS法由TRYGG等[21]于2002年提出，是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，其首要特點是排除了自變量（x）與分類變量（y）無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，使分類信息集中在一個或某幾個主成分中，從而使模型變得簡單、易于解釋，使得各組之間的判別效果以及多元統(tǒng)計分析得分圖的可視化效果更加明顯。OPLS回歸模型交叉驗證結(jié)果中的R2值反映模型的擬合程度，R2值越接近1表明模型擬合性越好；Q2值反映模型的預(yù)測能力，Q2值>0.9說明模型具有很好的預(yù)測能力，并且R2值與Q2值越接近說明模型建立的效果越好，一般認為R2值與Q2值相差不能超過0.5[22]。模型置換驗證結(jié)果中的R20值（R2在Y軸上的截距）及Q20值（Q2在Y軸上的截距）用于評估模型是否出現(xiàn)過擬合，一般認為R20<0.4和Q20<0.05，模型擬合較好[23]。本研究所建立的模型驗證結(jié)果表明所建立的4個溫度組模型成功、可靠，擬合程度好，未發(fā)生過擬合，說明模型的預(yù)測結(jié)果客觀、可信。從OPLS得分圖（圖3）可以看出，各溫度組各死亡時間點在圖中呈現(xiàn)一定的從左至右的分布趨勢，這反映了代謝物的整體變化呈現(xiàn)時間相關(guān)性。圖中還可見5℃模型死后3h、6h兩個組區(qū)分度較差，這可能與較低環(huán)境溫度下死后尸體內(nèi)相關(guān)代謝物含量變化緩慢有關(guān)，導(dǎo)致5℃模型推斷結(jié)果準確性的下降。

本研究所設(shè)置的4個溫度組模型所篩選出的差異代謝物分別為5℃組18種、15℃組15種、25℃組24種、35℃組30種，可以看出差異代謝物種類隨溫度升高呈增多趨勢，而WU等[14]和DAI等[15]所建立的單一溫度下的推斷模型，差異代謝物種類分別僅為13種和20種。因此，當預(yù)測樣本所處環(huán)境溫度高于模型所建立條件時，模型所涵蓋的代謝物信息會出現(xiàn)缺失，導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。本研究4個溫度組模型中篩選出6種共有的差異代謝物，分別為黃嘌呤、次黃嘌呤、甘油、磷酸甘油、丙氨酸和異亮氨酸。黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤分解代謝的中間產(chǎn)物，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下分解產(chǎn)生黃嘌呤，而黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下繼續(xù)分解生成尿酸。本研究中黃嘌呤和次黃嘌呤含量的不斷增高可能與機體死后細胞內(nèi)核苷酸不斷分解以及別嘌呤醇和黃嘌呤氧化酶活性不斷降低有關(guān)，因此無法形成最終的代謝產(chǎn)物尿酸。同時，有研究表明，細胞的死亡是不同步的[24]，特別是在低溫環(huán)境下核苷酸降解較慢[25]，因此，其含量變化呈現(xiàn)溫度相關(guān)性的遞進式增加。甘油是機體重要的能源物質(zhì)，也是合成脂肪的主要來源。機體死后，由于合成作用停止，隨著死亡時間的延長，脂肪逐漸分解成甘油和其他游離的脂肪酸。本研究中甘油含量隨死亡時間的延長而逐步增加，該結(jié)果與既往死后代謝組學(xué)研究結(jié)果[26]相吻合。磷酸甘油是甘油在甘油激酶的作用下轉(zhuǎn)變而來的，磷酸甘油還可以轉(zhuǎn)化成磷酸二羥丙酮參與糖酵解和糖異生。磷酸甘油也是脂質(zhì)合成的重要原料，因此，在死后早期其含量因脂質(zhì)合成停止而相對增高，后期含量減少可能與微生物活動逐漸增強有關(guān)[13]。在死后24h內(nèi)，丙氨酸和異亮氨酸的含量在不同溫度下隨死亡時間的延長不斷增高，這與相關(guān)研究[13]報道的結(jié)果一致。在較早期的研究中，也有學(xué)者[27]發(fā)現(xiàn)，腦組織中的丙氨酸和異亮氨酸等氨基酸也都隨著死亡時間的延長而增加，本研究進一步證明了這種氨基酸含量的變化規(guī)律。丙氨酸及異亮氨酸在大鼠死后的含量增加，可能有以下幾個原因[28]：（1）死后組織、蛋白在不同細菌以及細胞自身所含有的各種酶的影響下，不斷發(fā)生降解而形成丙氨酸、異亮氨酸；（2）由于機體死亡，蛋白質(zhì)合成停止，導(dǎo)致原本存在于血液中的丙氨酸及異亮氨酸等氨基酸無法形成肽鏈、蛋白等；（3）隨著細胞的裂解，細胞內(nèi)本身含有的一些氨基酸被釋放出來[29]，這也包括丙氨酸和異亮氨酸。因此，丙氨酸及異亮氨酸的含量在大鼠死后一段時間內(nèi)會隨著死亡時間的延長而逐漸增加。從圖2可以看出，不論是哪種代謝物，環(huán)境溫度為35℃時，代謝物相對含量變化幅度較其他溫度組大（各溫度組的溫度差均為10℃），可能是由于當環(huán)境溫度接近體溫（或更高）時，微生物的活動更加活躍，有研究[30-31]指出，體內(nèi)某些氨基酸和糖類等物質(zhì)含量會受到微生物活動的明顯影響。

利用5℃模型對15℃、25℃、35℃預(yù)測組樣本進行預(yù)測并對比后發(fā)現(xiàn)，5℃模型對其他溫度預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差與5℃預(yù)測組樣本預(yù)測結(jié)果的偏差之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且預(yù)測組環(huán)境溫度與模型溫度相差越大，預(yù)測結(jié)果偏差也越大。因此，當所需預(yù)測的樣本所處環(huán)境溫度與已建立模型的溫度條件不完全相同時，可以將其代入與其溫度相近的模型中進行預(yù)測，如預(yù)測樣本環(huán)境溫度為10℃、20℃時，可以嘗試將其分別代入與其溫度相近的5℃組模型以及15℃組模型中進行預(yù)測，以提高推斷結(jié)果的準確性。

由于本研究還處于動物實驗階段，應(yīng)用于實際工作尚有一定的難度。在未來，應(yīng)當收集人血液等組織類樣本建立推斷模型并進行預(yù)測，達到運用于實際的目的。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上設(shè)立了不同的環(huán)境溫度條件，納入了新的研究因素，嘗試模擬實際情況中不同的環(huán)境溫度。從研究結(jié)果來看，在利用代謝組學(xué)技術(shù)推斷死亡時間的研究中，進行環(huán)境溫度的考察、細化并建立不同環(huán)境溫度下的推斷模型，有望提高死亡時間推斷的準確性。