（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

骨骼肌挫傷是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中常見的機(jī)械性損傷，挫傷時(shí)間推斷是目前法醫(yī)學(xué)鑒定中的難點(diǎn)之一。既往推斷骨骼肌挫傷時(shí)間的研究大多是對單一物質(zhì)的表達(dá)變化進(jìn)行檢測，存在物質(zhì)的某一表達(dá)值對應(yīng)兩個(gè)甚至多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的現(xiàn)象，因此難以準(zhǔn)確界定挫傷時(shí)間的范圍。

代謝組學(xué)是在20世紀(jì)90年代后期，繼蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)之后發(fā)展起來的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新分支，以生物樣本中相對分子質(zhì)量<1000的小分子物質(zhì)為研究對象，如糖類、脂類、氨基酸、核苷酸等，通過氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等技術(shù)獲得大量的機(jī)體代謝物隨時(shí)間變化的信息，實(shí)現(xiàn)對機(jī)體受刺激或擾動前后代謝產(chǎn)物譜圖及其動態(tài)變化的整體監(jiān)測，利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLSDA）等多元統(tǒng)計(jì)分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，在已知高維數(shù)據(jù)中找到規(guī)律對未知樣本進(jìn)行判別分析[1]。近年來，代謝組學(xué)廣泛應(yīng)用于各學(xué)科領(lǐng)域的研究，HAO等[2]利用超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）代謝組學(xué)方法對慢性低劑量高滅磷中毒的大鼠尿液進(jìn)行分析，認(rèn)為可以將二甲基硫代磷酸鹽作為高滅磷中毒的敏感性指標(biāo)。朱士勝[3]運(yùn)用1HNMR代謝組學(xué)方法研究了彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）大鼠血漿中代謝物質(zhì)的變化，篩選出32種可能為DAI早期診斷提供可靠依據(jù)的特異性標(biāo)志物，說明了代謝組學(xué)用于進(jìn)行DAI早期診斷的可能。

本研究在建立大鼠骨骼肌不同挫傷時(shí)間模型基礎(chǔ)上，利用GC-MS技術(shù)獲取大鼠的血清代謝物數(shù)據(jù)，比較PCA、PLS-DA和OPLS-DA 3種模式識別方法的識別預(yù)測能力，選擇識別能力高的方法篩選生物標(biāo)志物；利用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）對所獲取的生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及建模，初步探討其在大鼠骨骼肌挫傷時(shí)間推斷中應(yīng)用的可能性，以期為大鼠骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組

健康成年雄性SD大鼠60只（購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司）被隨機(jī)分為10個(gè)實(shí)驗(yàn)組（傷后0、2、4、8、12、24、48、96、144、240 h組），1個(gè)對照組和1個(gè)驗(yàn)證組（傷后192 h組），每組5只。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵守四川省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會的規(guī)定，符合《實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指導(dǎo)》。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備與樣本收集

所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。參照自由落體打擊裝置[4]將500 g砝碼從90 cm高處自由下落，打擊1次造成大鼠左后肢骨骼肌挫傷。確保打擊處皮膚完整，皮下出血、腫脹伴爬行時(shí)患肢拖拉，脛腓骨未捫及骨折。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在傷后0、2、4、8、12、24、48、96、144、240h脫頸椎處死，驗(yàn)證組大鼠在傷后192h脫頸椎處死。對照組大鼠不造成損傷，在適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后脫頸椎處死。大鼠處死后立即從腹主動脈采血分離上清液凍存。取挫傷區(qū)中心肌肉標(biāo)本行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察骨骼肌的病理學(xué)改變。

1.2.2 樣本前處理

血清樣本：上述凍存的血清樣本解凍后取50μL于微量離心管中，與150 μL的-20℃冰乙腈混勻、渦旋，以離心半徑10cm，12000r/min，離心10min，取上清液吹干，肟化、硅烷化后加入內(nèi)標(biāo)硬脂酸甲酯庚烷溶液，渦旋靜置，取上清液進(jìn)行GC-MS分析。

質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本：取所有血清樣本各50 μL于10 mL離心管中混勻，制得QC樣本。取QC樣本50 μL于1.5 mL微量離心管中，加入冰乙腈150 μL，其余操作同血清樣本。QC樣本用于物質(zhì)定性，檢驗(yàn)儀器和樣本的穩(wěn)定性。

空白對照樣本：在空的杜氏小管中加入100 μL冰乙腈，用氮吹儀吹干，其余操作同血清樣本。與血清樣本、QC樣本代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，去除干擾物數(shù)據(jù)。

1.2.3 GC-MS檢測條件

使用7890A-5795C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），色譜分離采用DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣口溫度為250℃，輔助加熱器溫度為230℃，分流比為10∶1；起始溫度為60℃，保持1min，以8℃/min升至300℃，最后保持5min。質(zhì)譜離子源溫度為230℃，最大值為250℃，四極桿溫度為150℃，最大值為200℃，電離能量為70 eV，全掃描模式，掃描范圍m/z 50～600。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用AMDIS 6.51軟件（美國NIST公司）對GC-MS數(shù)據(jù)去卷積，以峰面積>10000、匹配度>80%[5]定性色譜峰，比對美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST；https://www.nist.gov）14質(zhì)譜庫、結(jié)合人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB；https://hmdb.ca）進(jìn)行色譜峰定性，通過色譜峰對齊、污染物排除、缺失值填補(bǔ)、數(shù)據(jù)歸一化等預(yù)處理后初步篩選生物標(biāo)志物，獲得代謝物名稱、保留時(shí)間、相對含量等信息，導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行PCA、PLS-DA、OPLS-DA，比較3種模式識別方法的識別預(yù)測能力。

為避免過擬合，采用交叉驗(yàn)證評估模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力[6]，Q2>0.5為可靠模型，Q2>0.9為優(yōu)秀模型，且 R2、Q2值差距不大于 0.2～0.3 為好[7]，R2、Q2值越接近1說明模型可靠性越強(qiáng)。以R2、Q2值比較3種模式識別方法的識別預(yù)測能力。置換驗(yàn)證用于驗(yàn)證模型的可靠度，R2與Q2值小于得分圖中原始值，并且Q2回歸直線與Y軸交點(diǎn)小于0說明該模型有效[8]。

通過以上標(biāo)準(zhǔn)選擇最佳模式識別方法，以變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1.0且單因素方差分析P<0.05為條件進(jìn)一步篩選生物標(biāo)志物。分別以初步篩選的生物標(biāo)志物和進(jìn)一步篩選出的生物標(biāo)志物相對含量作為輸入向量，以實(shí)際損傷時(shí)間為輸出向量建立SVM回歸模型，為防止模型過擬合，選擇70%數(shù)據(jù)（36個(gè)樣本）作為訓(xùn)練集，30%數(shù)據(jù)（14個(gè)樣本）作為測試集。以驗(yàn)證組（傷后192h組）數(shù)據(jù)為驗(yàn)證集，通過預(yù)測損傷時(shí)間與真實(shí)損傷時(shí)間的差值及預(yù)測損傷時(shí)間均方根誤差（root mean square error，RMSE）初步判斷模型預(yù)測能力。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨骼肌挫傷的病理學(xué)改變

對照組大鼠骨骼肌大體觀察及組織病理學(xué)檢驗(yàn)均未見明顯異常。

實(shí)驗(yàn)組大鼠大體觀察見損傷處皮膚完整，皮下出血、腫脹，解剖確定無脛腓骨骨折。組織病理學(xué)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨骼肌挫傷后即可見皮下出血，部分肌纖維斷裂。傷后2～4h出血加重，肌纖維變性，間質(zhì)水腫。傷后8h部分骨骼肌出現(xiàn)不同程度壞死，橫紋不清，間質(zhì)水腫加重，較多中性粒細(xì)胞浸潤。傷后12～24h骨骼肌進(jìn)一步壞死，橫紋消失，間質(zhì)水腫明顯，中性粒細(xì)胞較前增多，可見較多單核巨噬細(xì)胞和少量淋巴細(xì)胞（圖1）。傷后48h組織疏松水腫仍較明顯，中性粒細(xì)胞較前明顯減少，單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多，挫傷區(qū)大片肌細(xì)胞壞死解離。傷后96h損傷區(qū)周邊紅細(xì)胞溶解，周圍可見新生毛細(xì)血管出現(xiàn)，中性粒細(xì)胞進(jìn)一步減少，以單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞散在浸潤。傷后144～240h損傷區(qū)各炎癥細(xì)胞進(jìn)一步減少，可見肉芽組織形成。

圖1 對照組及傷后24h組大鼠骨骼肌的組織病理學(xué)變化（HE×400）Fig.1 Histopathological changes of skeletal muscle of rats in control group and 24h after injury group（HE×400）

2.2 生物標(biāo)志物的篩選

2.2.1 QC樣本分析

將QC樣本、對照組樣本和實(shí)驗(yàn)組樣本的所有代謝物數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件中進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)QC樣本分布較為集中，提示系統(tǒng)誤差小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠（圖2）。

圖2 PCA分析結(jié)果Fig.2 Results of PCA analysis

2.2.2 初步篩選生物標(biāo)志物

將前處理后的所有樣本進(jìn)行GC-MS檢測，獲得實(shí)驗(yàn)組與對照組代謝產(chǎn)物的原始譜圖（圖3，實(shí)驗(yàn)組以傷后48h組為例），因圖中色譜峰數(shù)量過多并有重疊現(xiàn)象，難以憑借肉眼區(qū)分譜圖的差異。

圖3 GC-MS檢測原始譜圖Fig.3 The original spectrum of GC-MS

將QC樣本與NIST 14質(zhì)譜庫比對，結(jié)合HMDB數(shù)據(jù)庫共選出60種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。各實(shí)驗(yàn)組樣本和對照組樣本經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，篩選出31種代謝產(chǎn)物，主要是酸類、糖類、脂類等物質(zhì)（表1）。

表1 篩選出的代謝物及其保留時(shí)間Tab.1 Selected metabolites and their retention time（時(shí)間/s）

2.2.3 進(jìn)一步篩選生物標(biāo)志物

分別以PCA、PLS-DA、OPLS-DA 3種模式識別方法對各實(shí)驗(yàn)組與對照組、相鄰時(shí)間實(shí)驗(yàn)組兩兩之間進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果模型均驗(yàn)證成功（圖4～5，以對照組和傷后24 h組比較為例），且3種模式識別方法均能將各樣本明顯分離，其中OPLS-DA模式下R2、Q2值更接近1，提示該方法的識別預(yù)測能力最佳。故對全部實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行OPLS-DA分析，進(jìn)一步篩選生物標(biāo)志物。

圖4 對照組和傷后24h組得分圖Fig.4 Score plots of 24h after injury group and control group

圖5 對照組和傷后24h組比較的模型置換驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Model replacement test in comparison of 24h after injury group and control group

在OPLS-DA模式下，以VIP>1.0且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出6種生物標(biāo)志物，分別為單硬脂酸甘油酯、乙醇胺、纈氨酸、來蘇糖、酪氨酸、棕櫚酸。6種生物標(biāo)志物的相對含量在骨骼肌挫傷后的變化見表2。單硬脂酸甘油酯含量在挫傷當(dāng)時(shí)明顯高于對照組，傷后4 h迅速下降至最低值，而后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。乙醇胺含量在傷后2、24、96h出現(xiàn)3次峰值，在8、48h出現(xiàn)2次谷值。纈氨酸含量在挫傷當(dāng)時(shí)低于對照組，后逐漸升高，至2h達(dá)第1個(gè)峰值后開始下降，至傷后12h降至谷值后開始上升，并于48h出現(xiàn)第2個(gè)峰值，于144h降至最低值后再次上升。來蘇糖含量在挫傷當(dāng)時(shí)高于對照組，隨后開始下降，至8h達(dá)最低值，后續(xù)在24h和144h出現(xiàn)2次峰值，在48h出現(xiàn)一次谷值。酪氨酸含量在挫傷當(dāng)時(shí)低于對照組，后上升，至4h達(dá)峰值后開始下降，于12h時(shí)降至最低值后再次上升，于96h時(shí)達(dá)最高峰。棕櫚酸含量在傷后2h達(dá)到峰值，之后隨時(shí)間延長出現(xiàn)波動，至傷后48h降至最低值。由上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，6種生物標(biāo)志物含量隨時(shí)間變化的規(guī)律性欠佳，難以用于進(jìn)行骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷。

2.3 SVM回歸模型的建立

2.3.1 建立SVM回歸模型

分別以31種和6種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)為輸入向量，實(shí)際損傷時(shí)間為輸出向量進(jìn)行SVM建模，訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果見表3。發(fā)現(xiàn)相較于6種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)，使用31種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)作為輸入向量時(shí)，訓(xùn)練集和測試集所識別的挫傷時(shí)間都更接近真實(shí)挫傷時(shí)間。

表2 實(shí)驗(yàn)組及對照組6種代謝物相對含量變化Tab.2 Changes of 6 metabolites in experimental group and control group［n=5，±s，濃度（/μmol/L）］

表2 實(shí)驗(yàn)組及對照組6種代謝物相對含量變化Tab.2 Changes of 6 metabolites in experimental group and control group［n=5，±s，濃度（/μmol/L）］

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與相鄰上組比較，P<0.05。

組別對照傷后0h傷后2h傷后4h傷后8h傷后12h傷后24h傷后48h傷后96h傷后144h傷后240h單硬脂酸甘油酯45.54±8.15 164.24±1.281）35.00±2.571）2）33.39±4.531）37.86±4.111）38.57±1.83 47.85±4.922）36.78±6.281）2）41.53±7.30 50.26±8.702）52.88±4.701）乙醇胺41.13±3.03 43.90±5.04 66.57±1.441）2）59.51±2.941）2）43.50±2.862）48.33±1.341）2）64.80±4.951）2）47.94±1.881）2）71.56±4.611）2）67.59±2.391）58.15±3.411）2）纈氨酸366.30±5.98 280.29±5.141）587.08±5.761）2）501.08±14.811）2）312.29±8.561）2）221.17±11.431）2）276.72±22.701）2）781.10±21.311）2）612.30±12.511）2）128.41±12.481）2）629.76±16.111）2）來蘇糖68.61±5.20 118.16±5.451）115.94±7.051）84.58±18.711）2）48.14±9.241）2）60.72±6.20 110.53±18.141）2）74.56±11.002）81.97±13.01 113.88±7.421）2）92.76±16.141）2）酪氨酸229.04±16.66 122.30±5.551）240.14±13.522）243.65±19.16 164.34±48.011）2）128.38±21.241）2）185.69±19.731）2）216.64±10.64 268.55±6.161）2）225.32±37.092）222.59±32.742）棕櫚酸389.80±54.96 494.80±12.251）641.33±77.741）2）501.54±9.011）2）567.95±51.641）2）498.70±48.281）2）502.68±8.501）340.77±3.901）2）385.79±6.74 406.62±37.25 404.59±18.84

表3 SVM回歸模型訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果Tab.3 Prediction results of training set and test set of SVM regression model （±s，時(shí)間/h）

表3 SVM回歸模型訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測結(jié)果Tab.3 Prediction results of training set and test set of SVM regression model （±s，時(shí)間/h）

注：“-”表示無數(shù)據(jù)。

訓(xùn)練集樣本數(shù)/n測試集樣本數(shù)/n組別傷后0h傷后2h傷后4h傷后8h傷后12h傷后24h傷后48h傷后96h傷后144h傷后240h 4534434342 6種生物標(biāo)志物預(yù)測值1.306±1.047 11.259±11.551 26.247±5.489 11.574±1.900 12.545±2.606 28.937±7.883 48.995±5.941 79.405±14.625 82.204±17.152 40.314±4.085 31種生物標(biāo)志物預(yù)測值0.094±0.012 1.935±0.090 3.990±0.102 8.002±0.118 12.270±0.289 24.029±0.113 48.306±0.937 96.013±0.119 144.040±0.122 240.010±0.127 1021121213 6種生物標(biāo)志物預(yù)測值6.979-25.312±1.532 10.555 12.344 36.617±10.116 44.353 72.451±4.781 52.474 39.122±3.873 31種生物標(biāo)志物預(yù)測值0.954-3.744±3.057 6.575 12.179 24.552±0.902 50.271 95.625±1.969 144.580 240.701±2.572

2.3.2 SVM回歸模型驗(yàn)證

將驗(yàn)證組（傷后192h組）血清樣本的相應(yīng)代謝物數(shù)據(jù)分別代入6種和31種生物標(biāo)志物的SVM回歸模型中進(jìn)行骨骼肌挫傷時(shí)間推斷。結(jié)果顯示，以31種生物標(biāo)志物建立的SVM回歸模型的推斷準(zhǔn)確性較高（表4）。

表4 SVM回歸模型驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Validation results of SVM regression model（n=5，±s，時(shí)間/h）

表4 SVM回歸模型驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Validation results of SVM regression model（n=5，±s，時(shí)間/h）

注：RMSE為均方根誤差。

RMSE 136.819 4.052生物標(biāo)志物6種31種預(yù)測損傷時(shí)間55.344±7.485 195.781±1.629

3 討 論

3.1 骨骼肌挫傷動物模型及GC-MS數(shù)據(jù)可靠性評價(jià)

建立骨骼肌挫傷動物模型的方法有多種，不同的方法造成骨骼肌挫傷的機(jī)制相同，但骨骼肌挫傷的程度并不一致，實(shí)際應(yīng)用中以重物自由落體打擊法應(yīng)用較多。本研究在以往研究基礎(chǔ)上通過研究自由落體打擊裝置所建立的骨骼肌挫傷模型，其病理學(xué)改變典型，適用于骨骼肌挫傷的相關(guān)研究。

在代謝組學(xué)研究中，儀器狀態(tài)不穩(wěn)定、操作誤差等均會降低代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性，所以有必要設(shè)置QC樣本對儀器穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可靠性進(jìn)行檢測[9]。本研究中QC樣本由所有樣本等比例混合所得，所含成分相同，在正常樣本之間穿插進(jìn)樣，利用PCA模式對包括QC樣本在內(nèi)的所有樣本進(jìn)行分析，如果QC樣本在PCA得分圖上緊密聚集，則說明儀器穩(wěn)定，代謝物數(shù)據(jù)可靠。本研究發(fā)現(xiàn)，QC樣本分布較為集中，提示本研究所用儀器穩(wěn)定，所獲代謝物數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。

3.2 生物標(biāo)志物含量在骨骼肌挫傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用價(jià)值

本研究應(yīng)用OPLS-DA模式共篩選出單硬脂酸甘油酯、乙醇胺、纈氨酸、來蘇糖、酪氨酸、棕櫚酸6種生物標(biāo)志物，其含量在骨骼肌挫傷后均隨時(shí)間延長出現(xiàn)變化，但是并無明顯規(guī)律，難以用于骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷。原因可能為OPLS-DA主要是基于線性回歸的方法在不同類別之間建立數(shù)學(xué)模型，使不同類別的樣本分離最大化，從而發(fā)現(xiàn)不同類別之間的差異性代謝物[10]，而代謝組學(xué)數(shù)據(jù)并不能用簡單的線性關(guān)系來表述[11]。綜上，OPLS-DA模式能夠較好地解決代謝組學(xué)研究中的分類問題，并能尋找出導(dǎo)致類別不同的生物標(biāo)志物，但不能根據(jù)生物標(biāo)志物的含量變化直接進(jìn)行骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷。魯翰霖[12]對大鼠挫傷后0.5、1、2 h的骨骼肌進(jìn)行代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)各對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)及損傷后2h內(nèi)均有特征代謝差異物及持續(xù)表達(dá)的差異代謝產(chǎn)物，差異代謝物與三羧酸循環(huán)、糖酵解、蛋白質(zhì)等多個(gè)代謝途徑相關(guān)，參與了損傷早期骨骼肌抗氧化、清除壞死組織、能量供給、挫傷區(qū)蛋白質(zhì)降解與生成等過程。本研究中，生物標(biāo)志物為血清中脂類代謝物及氨基酸，其含量波動可能與損傷后能量代謝有關(guān)，相關(guān)代謝通路尚待進(jìn)一步研究，以明確其含量發(fā)生差異性變化的代謝機(jī)制。

3.3 SVM回歸模型在骨骼肌挫傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用評價(jià)

本研究中，以6種生物標(biāo)志物和31種生物標(biāo)志物均成功建立了推斷挫傷時(shí)間的SVM回歸模型。根據(jù)6種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)建立SVM回歸模型時(shí)，在訓(xùn)練集、測試集中預(yù)測損傷時(shí)間與實(shí)際損傷時(shí)間差距均較大；對驗(yàn)證組大鼠的骨骼肌挫傷時(shí)間進(jìn)行推斷時(shí)結(jié)果為（55.344±7.485）h，與實(shí)際損傷時(shí)間（192 h）之間差值較大且RMSE值較高。根據(jù)31種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)建立SVM回歸模型時(shí)，在訓(xùn)練集、測試集中預(yù)測損傷時(shí)間與實(shí)際損傷時(shí)間差距均較?。粚︱?yàn)證組大鼠的骨骼肌挫傷時(shí)間進(jìn)行推斷時(shí)結(jié)果為（195.781±1.629）h，與實(shí)際損傷時(shí)間（192 h）較為接近且RMSE值較低。以上結(jié)果提示，根據(jù)31種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)建立的SVM回歸模型的準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于根據(jù)6種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)建立的SVM回歸模型的準(zhǔn)確性，利用31種生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)建立的SVM回歸模型用來進(jìn)行骨骼肌挫傷時(shí)間推斷的可靠性較高，其原因可能是31種代謝物的信息含量多于6種生物標(biāo)志物的信息含量。顧嘉運(yùn)等[13]發(fā)現(xiàn)，樣本量達(dá)到一定值時(shí)繼續(xù)增加樣本量并不能增加SVM回歸預(yù)測的準(zhǔn)確度，本研究中特征量的多少與SVM回歸預(yù)測準(zhǔn)確度之間是否存在類似的關(guān)系，以及具體需要多少特征量以使SVM回歸模型推斷骨骼肌挫傷時(shí)間的能力達(dá)到最大化需后續(xù)進(jìn)一步分析研究。近年來，許多研究[14-17]結(jié)果表明，大鼠骨骼肌損傷后相關(guān)蛋白的表達(dá)及炎癥因子水平隨損傷時(shí)間延長呈現(xiàn)時(shí)序性變化，有望用于損傷時(shí)間的推斷，但隨著損傷時(shí)間的延長，機(jī)體代償、恢復(fù)，可能會出現(xiàn)同一表達(dá)水平對應(yīng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的情況。DU等[18]研究了大鼠骨骼肌挫傷后相關(guān)愈合基因的表達(dá)，構(gòu)建預(yù)測模型并引入外部數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示基因表達(dá)模型和多變量分析有望用于損傷時(shí)間的推斷。

本研究利用代謝組學(xué)和SVM回歸模型對骨骼肌挫傷時(shí)間進(jìn)行推斷，為尋找、探究生物標(biāo)志物用于推斷骨骼肌挫傷時(shí)間提供了新的思路。但本研究發(fā)現(xiàn)，不同數(shù)量代謝物信息推斷損傷時(shí)間差異較大，且驗(yàn)證組樣本過少未能進(jìn)一步評估預(yù)測模型的泛化能力，后續(xù)研究可進(jìn)一步明確生物標(biāo)志物參與的代謝通路、優(yōu)化構(gòu)建SVM回歸模型的代謝物數(shù)量、引入多時(shí)間組的外部驗(yàn)證，以提高該方法推斷骨骼肌挫傷時(shí)間的準(zhǔn)確性和可行性。