（北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101318）

1 案 例

1.1 簡要案情

2017年7月，本鑒定中心受某地委托，要求幫助趙某（男）和朱某（男）從40余塊混合的陳舊斷骨檢材中找到親屬的遺骨。通過溝通了解到，在某湖的施工過程中，誤挖出40余塊陳舊骨骼，其中有趙某父親（死于1967年）和朱某爺爺（死于1949年）的尸骨。

1.2 DNA檢驗(yàn)

1.2.1 DNA提取

樣本為45塊骨骼樣本（依次編為1～45號）、趙某血痕樣本（編為46號）以及朱某血痕樣本（編為47號）。用手術(shù)刀和超純水清理骨骼樣本表面，清洗干凈后自然晾干。45塊骨骼樣本大部分為斷骨，骨髓腔內(nèi)充滿泥土，長短不一（7～28 cm），大部分表現(xiàn)為中空、手感輕、硬度低、韌性差，部分骨骼可輕易折斷。

用電鉆鉆取骨骼樣本較厚的部位獲得骨屑。骨骼DNA的提取純化采用MagAttract M48 DNA Manual試劑盒（德國Qiagen公司，簡稱M48試劑盒）。各樣本取2g骨屑分別置于50mL離心管中，加入1000μL消化液 Buffer G2（德國 Qiagen公司）、300 μL脫鈣液［0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），pH=8.0］、200 μL二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）溶液（1 mol/L）以及200 μL蛋白酶K溶液（20 mg/mL），液面淹沒檢材，振蕩混勻，將樣本置于56℃恒溫水浴搖床中消化，其間補(bǔ)加1次蛋白酶K溶液和DTT溶液。后續(xù)DNA提取純化參照M48試劑盒說明書進(jìn)行，用預(yù)熱的洗脫液重復(fù)洗脫1次，洗脫體系為30μL。

趙某和朱某的血痕樣本采用《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T 383—2014）中的Chelex法提取DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與STR分型

取上述DNA溶液為模板，依次采用GlobalFilerTMExpress PCR Amplification Kit（美國 Applied Biosystems公司）和Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)26Y［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］在9700型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3500xL基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用GeneMapperTMID-X v1.5軟件進(jìn)行基因型分析。

反應(yīng)體系和操作程序均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 檢驗(yàn)結(jié)果

2、11、15號骨骼樣本中檢出部分STR分型，46、47號血痕樣本得到完整分型，2、11、15、46、47號樣本在常染色體STR基因座的分型結(jié)果見表1。

11號骨骼樣本和46號血痕樣本在檢出的20個(gè)常染色體STR基因座的分型結(jié)果均符合孟德爾遺傳定律，經(jīng)計(jì)算，累積親權(quán)指數(shù)大于10000；11號骨骼樣本和46號血痕樣本檢出的Y-STR分型結(jié)果一致，參照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223—2018），支持11號骨骼樣本所屬個(gè)體與趙某（46號樣本所屬個(gè)體）為生物學(xué)父子關(guān)系。

參照文獻(xiàn)[1-2]的方法，用ITO法計(jì)算2號骨骼樣本與47號血痕樣本的祖孫關(guān)系指數(shù)?；贗TO法，祖孫關(guān)系具有同源基因的概率（φ值）與半同胞關(guān)系一樣，故用ITO法計(jì)算兩個(gè)人的祖孫關(guān)系指數(shù)可參照半同胞指數(shù)（half sibling index，HSI）的計(jì)算。經(jīng)計(jì)算，2號骨骼樣本與47號血痕樣本的祖孫關(guān)系指數(shù)大于19，傾向于認(rèn)為2號骨骼樣本所屬個(gè)體與朱某（47號樣本所屬個(gè)體）為祖孫親緣關(guān)系。同時(shí)，2號骨骼樣本與47號血痕樣本的Y-STR分型結(jié)果一致，不排除具有同一父系親緣關(guān)系，可輔助判斷上述結(jié)果。

表1 2、11、15、46、47號樣本常染色體STR基因座的分型結(jié)果Tab.1 Typing result of autosomal STR gene locus of No.2，11，15，46，47 samples

2 討 論

陳舊性骨骼樣本受保存時(shí)間和環(huán)境因素的影響，骨骼中的糖蛋白等蛋白質(zhì)可能和DNA產(chǎn)生亞甲基化學(xué)交聯(lián)。DNA的氧化導(dǎo)致堿基的缺失或更迭，酸、堿催化作用都可導(dǎo)致堿基本身水解脫氨基，保存時(shí)間和環(huán)境等因素的影響可導(dǎo)致骨骼DNA嚴(yán)重降解[3]，因此如何提取高質(zhì)量的DNA是骨DNA分析的關(guān)鍵。

隨著DNA提取技術(shù)的發(fā)展以及提取經(jīng)驗(yàn)的積累，骨骼DNA的提取方法多樣并不斷優(yōu)化，骨骼DNA的提取不再是難題，尤其是保存時(shí)間在30年以內(nèi)、保存狀態(tài)完整的骨骼樣本，DNA檢出率高達(dá)90%以上[4]。本案例中，45塊骨骼樣本中僅檢出3個(gè)樣本的STR分型，推測原因?yàn)椋海?）骨骼保存年限較長，為50年以上；（2）骨骼完整程度不佳，大部分為斷骨，多表現(xiàn)為中空、手感較輕、韌性差等，這都為本案例骨骼的DNA提取工作增加了難度。檢索文獻(xiàn)[5-7]并結(jié)合現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件和檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)對此類樣本的提取方法總結(jié)如下：（1）增加骨屑用量，適當(dāng)延長消化時(shí)間。因檢材較陳舊，骨骼細(xì)胞中DNA降解嚴(yán)重，DNA提取純化過程中會(huì)損失部分DNA，所以增加骨屑用量，延長裂解消化時(shí)間，可促使骨骼細(xì)胞中的微量DNA充分釋放。（2）裂解消化與脫鈣同時(shí)進(jìn)行。人類骨組織細(xì)胞間質(zhì)主要由膠原蛋白和羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］構(gòu)成，EDTA作為一種螯合劑可螯合間質(zhì)中起穩(wěn)固作用的鈣，從而破壞骨組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使骨骼中的DNA更充分地釋放[6]。但是骨骼樣本在脫鈣過程中會(huì)導(dǎo)致部分DNA的流失，所以裂解和消化同時(shí)進(jìn)行既可減少DNA的損失，又可節(jié)省時(shí)間，還可以減少操作步驟避免DNA的污染。（3）減少洗脫體積。本案例中使用M48試劑盒提取，洗脫體積為30μL，且用預(yù)熱的洗脫液重復(fù)洗脫1次，可增加DNA獲得率，有效提高DNA模板的濃度。

在峰圖判型方面，單純一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不可靠，李成濤等[8]也提出實(shí)驗(yàn)室工作人員對微量或高度降解的檢材進(jìn)行檢測時(shí)須特別注意防止污染，對于某些重復(fù)性不好或雜峰較多的基因座，將不予采信?？傊?，微量檢材的判型必須嚴(yán)謹(jǐn)、慎重。