賀瀟宇 趙立 魏丹 蔣靜怡 龐文生 胡娟

【摘 要】 目的：建立一種太子參環(huán)肽單體的分離制備方法。方法：采用硅膠柱層析分離制備太子參環(huán)肽粗分物，經(jīng)制備級(jí)高效液相色譜（HPLC）純化，使用質(zhì)譜（MS）、核磁共振波譜（NMR）及二維核磁共振波譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果：通過質(zhì)譜、核磁共振波譜法確定了所得環(huán)肽為太子參環(huán)肽Pseudostellaria A（PA）。結(jié)論：建立一種太子參環(huán)肽PA的分離制備方法，提取率為32.5 μg/g，純度為95.16%。

【關(guān)鍵詞】 太子參;環(huán)肽;核磁共振波譜法;質(zhì)譜法;柱層析

【中圖分類號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）21-0047-06

Isolation，Preparation and Structural Characterization of a kind of Pseudostellaria heterophylla Cyclic Eeptide Monomer

HE Xiaoyu1 ZHAO Li1 WEI Dan1 JIANG Jingyi1 PANG Wensheng1 HU Juan1，2*

1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China;

2.The Second Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China

Abstract：Objective To establish a method for the separation and preparation of Pseudostellaria heterophylla cyclic peptide monomer.Methods The crude cyclic peptide of Pseudostellaria heterophylla was separated and prepared by silica gel column chromatography，purified by preparative High Performance Liquid Chromatography（HPLC），and its structure was characterized by Mass spectrometry （MS），Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy （NMR） and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy.Results The obtained cyclic peptide was determined to be Pseudostellaria A （PA） by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.Conclusion A method for the separation and preparation of Pseudostellaria heterophylla cyclic peptide PA has been established，the extraction rate is 32.5 μg/g，and the purity is 95.16%.

Keywords：Pseudostellaria heterophylla; Cyclic Peptide; Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy; Mass Spectrometry; Column Chromatography

環(huán)肽（Cyclic Peptide）是指氨基酸以肽鍵的形式連接形成的環(huán)狀化合物[1]。研究結(jié)果表明環(huán)肽類化合物僅存在于一些高等植物體內(nèi)存在，這些環(huán)肽結(jié)構(gòu)新奇多樣，骨架中除了肽鍵外還有酯鍵、醚鍵、二硫鍵等，很多環(huán)肽具有良好的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和免疫抑制等活性[2]。環(huán)肽能夠形成穩(wěn)定的限制性空間構(gòu)象，而且其在生物體內(nèi)抗降解的能力也強(qiáng)于線性多肽。奇特的結(jié)構(gòu)和豐富的活性使天然活性環(huán)肽成為化學(xué)家和藥學(xué)家研究的熱點(diǎn)。

太子參，系石竹科孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根[3]，其含有多種生物活性成分，如多糖類、環(huán)肽類、微量元素、皂苷類、揮發(fā)油類、油脂類、氨基酸類、脂肪酸類等[4]。目前已報(bào)道的太子參環(huán)肽有16種，有環(huán)八肽、環(huán)七肽、環(huán)五肽等數(shù)種大小不同的環(huán)肽[5]。本課題組建立了一種太子參環(huán)肽提取物（CPE）的制備方法，并且研究了環(huán)肽提取物抗慢性阻塞性肺病（COPD），結(jié)果表明CPE給藥組大鼠肺氣道阻力急劇下降，動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性升高。肺組織切片圖像分析顯示，CPE可減輕肺泡破壞程度，減輕肺組織炎癥，增加肺泡間隙，改善COPD大鼠肺通氣功能，這可能與其抑制TLR4-MyD88-JNK/p38通路異常激活有關(guān)[6-7]。李軍等[8]

發(fā)現(xiàn)太子參環(huán)肽HB具有酪氨酸酶抑制活性，可以用于色素沉積引起的皮膚病。

本實(shí)驗(yàn)利用柱層析、制備級(jí)高效液相色譜等技術(shù)，分離純化得到一種太子參環(huán)肽單體，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，確定了該環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為太子參環(huán)肽單體的分離制備提供了一種方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備 Shimazu LC-8A 型制備液相色譜儀（日本島津公司）;KQ-500DV型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）;600Y型多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）;AE240s型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;DW-86L728J超低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)）;MODULYOD-230真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo公司）;R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）;GZY-P2D-W型超純水機(jī)（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）;Bruker Esquire 2000 MS（德國(guó)布魯克公司）;Bruker AV400 NMR（德國(guó)布魯克公司）。玻璃器皿均購(gòu)于天津玻璃儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 太子參[Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax et Hoffm.]，購(gòu)于福建柘榮。甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司），無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司）、乙酸乙酯（AR，西隴化工股份有限公司）、石油醚（AR，西隴化工股份有限公司）、環(huán)己烷（AR，西隴化工股份有限公司）、硅膠（100～200目，北京索萊寶科技有限公司）、硅膠（200～300目，北京索萊寶科技有限公司）、實(shí)驗(yàn)用水為電阻率為18.2 MΩ的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 太子參環(huán)肽的柱層析分離 稱取干燥太子參200 g（粉碎過3號(hào)篩），按料液比1∶8加入85%乙醇回流提取2 h，減壓濃縮得乙醇浸膏。乙醇浸膏加水溶解，按體積比1∶1加入石油醚萃取3次，棄去水層，合并石油醚層。減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥;得石油醚萃取部位。

取石油醚萃取部位100 g，等量硅膠拌樣后，600 g 硅膠（100～200目）裝柱，濕法上樣，以石油醚、乙酸乙酯（體積比50∶1→1∶1）系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度至少洗5個(gè)柱體積，每300 mL為一個(gè)餾分，經(jīng)薄層色譜法定性檢驗(yàn)，收集可能為環(huán)肽的餾分。得粗分片段，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥，得粗分物粉末。

取粗分物35 g，50 g硅膠拌樣，300 g硅膠（200～300目）裝柱，經(jīng)環(huán)己烷、乙酸乙酯（體積比100∶0→20∶1→10∶0→8∶1→5∶1）系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度至少洗5個(gè)柱體積，每300 mL為一個(gè)餾分，經(jīng)薄層色譜法定性檢驗(yàn)，收集可能為環(huán)肽的餾分。

2.2 太子參環(huán)肽單體的純化 所得餾分采用制備級(jí)HPLC純化。色譜柱為SinoChrom ODS-BP Cl8（250mm×10 mm，5 μm）;流速5 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量1 mL。已甲醇（A）：水（B）=65∶35為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。收集環(huán)肽單體峰，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥，得到淡黃色粉末。

所收集環(huán)肽組分峰HPLC測(cè)定純度。采用大連依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱;流速1mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL;以乙腈（A）：水（B）=10∶90為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

2.3 太子參環(huán)肽結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 MS結(jié)構(gòu)表征 Bruker Esquire 2000 質(zhì)譜儀進(jìn)樣條件：離子源：ESI;離子模式：陽(yáng)離子模式;正負(fù)離子切換：關(guān)閉;掃描模式：標(biāo)準(zhǔn)/正常;質(zhì)量范圍50～2200 m/z;毛細(xì)出口電壓：116.7 V;透鏡：40.8 V;阱驅(qū)動(dòng)參數(shù)：30.1;采集時(shí)間：2992 μs。

2.3.2 NMR結(jié)構(gòu)表征 取所得淡環(huán)肽10 mg，溶于0.6 mL氘代DMSO中，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的核磁管中，使用四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標(biāo)，恒溫25 ℃，由Bruker AV400 NMR測(cè)定其1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY及HMBC譜圖。

2.4 結(jié)果

2.4.1 太子參環(huán)肽HPLC純度測(cè)定 所得太子參環(huán)肽單體純度按照面積歸一化法測(cè)定為95.16%，HPLC色譜圖如圖1所示，峰面積見表1。

2.4.2 MS譜圖及結(jié)構(gòu)解析 由圖2A可知，正離子模式的分子離子峰為m/z=502.2的[M+H]+峰; m/z=524.2的[M+Na]+峰;由圖2 B可知，負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z=500的[M-H]-提示該環(huán)肽分子量為501.26。且正離子模式下有m/z=540.1的[M+K]+峰;m/z=474.3的[M-CO]+峰，分子量為單數(shù)，提示化合物含有奇數(shù)氮原子。表2為環(huán)肽正負(fù)離子模式下的離子峰質(zhì)荷比。

2.4.3 NMR譜圖及結(jié)構(gòu)解析 由表3可知，1H-NMR、13C-NMR譜圖中C原子、H原子的化學(xué)位值，并給出了基于HMBC、1H-1H COSY的C-H，H-H耦合關(guān)系。

由圖3A1H-NMR （400MHz，in DMSO）可知：高場(chǎng)區(qū)δ 1.25、0.77、0.95為3個(gè)甲基氫;低場(chǎng)區(qū)δ 8.50、7.95、7.85、7.23為氨基氫信號(hào);δ6.63、6.93兩組氫信號(hào)，為同一個(gè)苯環(huán)上的4個(gè)氫信號(hào)。由圖3 B 13C-NMR （400MHz，in DMSO）：該化合物含有25個(gè)碳原子，低場(chǎng)區(qū)有5個(gè)羰基碳信號(hào)，還有1個(gè)芳香連氧碳信號(hào)，5個(gè)芳香碳信號(hào)，且氫譜數(shù)據(jù)中有對(duì)稱的芳香氫信號(hào)，提示此化合物連有1個(gè)4-羥基苯。

由圖4 A 1H-1H COSY譜圖可以判斷出質(zhì)子間的2鍵、3鍵耦合關(guān)系;由圖4 B HMBC譜圖可以判斷出碳原子與質(zhì)子的2鍵、3鍵耦合關(guān)系，綜合二維譜圖推測(cè)出環(huán)肽可能含有的片段如圖5所示。

綜合以上NMR譜圖并結(jié)合MS信息確定環(huán)肽化學(xué)結(jié)構(gòu)，其分子式為C25H35N5O6，并給按照表2中的原子編號(hào)順序給出了NMR信號(hào)歸屬，如圖6所示。

3 討論

實(shí)驗(yàn)前期對(duì)太子參的提取條件進(jìn)行了考察，以指紋圖譜作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了以85%乙醇作為提取溶劑，料液比（g/mL）為1∶8，回流提取2 h。柱層析采用濕法裝柱，先在層析柱中加入少量洗脫劑，然后將洗脫劑浸泡的硅膠攪拌成勻漿后倒入層析柱中，用玻璃棒輕輕敲打柱兩側(cè)，待硅膠層沉積后，加壓，趕走柱內(nèi)殘留的小氣泡，最后用真空泵將填料抽實(shí)。

太子參環(huán)肽作為太子參的特色活性成分，具有多種藥理活性，但由于含量較低，分離制備具有一定的難度，限制了太子參環(huán)肽的應(yīng)用。目前，已經(jīng)有較多的研究人員從指紋圖譜的角度對(duì)太子參環(huán)肽進(jìn)行了研究，但這些研究的重點(diǎn)均在于應(yīng)用GC-MS、LC-MS對(duì)指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行鑒定。并沒有解決目前太子參環(huán)肽單體分離制備方法不足的問題。

4 結(jié)論

通過柱層析技術(shù)分離獲得環(huán)肽粗分物，經(jīng)制備級(jí)HPLC純化獲得環(huán)肽單體，對(duì)其進(jìn)行MS、NMR結(jié)構(gòu)表征，并結(jié)合參考文獻(xiàn)[9-10]確定其為環(huán)肽化合物Pseudostellarin A （PA）。2 kg太子參藥材提取得環(huán)肽PA約65 mg，提取率（PA/藥材）為32.5 μg/g，所得環(huán)肽PA純度為95.16%。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種太子參環(huán)肽PA的分離純化方法，通過柱層析初步分離獲得環(huán)肽粗分物，再經(jīng)過制備級(jí)HPLC純化獲得純度較高的PA單體，并運(yùn)用現(xiàn)代波譜分析技術(shù)確定了環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)太子參環(huán)肽PA藥理活性研究提供了一定的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-09-01 編輯：程鵬飛）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81673575）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”重點(diǎn)專項(xiàng)（2019YFC1710504）。

作者簡(jiǎn)介：賀瀟宇（1996-），男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)活性成分研究。E-mail：975019071@qq.com

通信作者：胡娟（1962-），女，土家族，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞峙c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn