萬 月，文慶蓮

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646000)

大腸癌是第三大最常被診斷出的癌癥[1]。不管是在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，結腸癌的發(fā)病率和死亡率仍在上升[1-2]，這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)反映出有必要進一步了解這種疾病，并為結腸直腸癌患者提供新的治療方法。傳統(tǒng)的化放療由于腫瘤耐藥、毒性等原因已經(jīng)難以滿足臨床的需要?；瘜W抗腫瘤藥物經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展，已經(jīng)進入靶向治療藥物時代。

熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)是存在于細胞中的分子量為90kDa的熱休克蛋白[3]，是一個保護蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定所需的蛋白質(zhì)，參與細胞內(nèi)信號轉導如AKT及轉錄激活因子(STAT3)等調(diào)節(jié)細胞生存、增殖和分化[4-5]。HSP90作為分子伴侶，在正常生理條件下，參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、運輸和降解、寡聚體的形成和解聚等過程[6]。在發(fā)生應激反應時，HSP90 可以和那些由于環(huán)境刺激而使自身構象發(fā)生改變的蛋白相互作用，保證蛋白進行適當?shù)恼郫B并防止其非特異性聚集，從而維持細胞的正常生理功能。HSP90在相對于正常組織的許多類型的癌癥中均過表達，其客戶蛋白與許多致瘤途徑有關，因此被認為是潛在的抗癌藥物靶標[7]。格爾德霉素衍生物是最早發(fā)現(xiàn)的HSP90抑制劑，但其具有明顯的脫靶毒性，例如肝毒性，眼和心臟毒性，從而限制了藥物的進一步臨床開發(fā)[8-10]。SNX-2112是一種新型的HSP90抑制劑，它以高親和力與HSP90的N末端ATP結合位點結合，是治療各種癌癥的有希望的候選藥物[11]。本研究通過HSP90的特異性抑制劑SNX2112作用于結腸癌細胞HCT116，通過MTT實驗、劃痕實驗觀察藥物毒性和細胞遷移情況，通過流式細胞儀檢測凋亡和周期觀察藥物的促凋亡作用和對周期的抑制，并研究其對信號傳導及轉錄激活因子(STAT3)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)等相關信號蛋白的調(diào)控機制，為HSP90抑制劑治療結腸癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 1 640培養(yǎng)液(HyClone公司，美國)；胰蛋白酶 (Sigma公司，美國)；胎牛血清(HyClone公司，美國)；培養(yǎng)板 (Corning Costar公司,美國)；SNX2112 (MCE公司，美國)；MTT檢測試劑盒 (索萊寶公司，中國)；細胞凋亡與周期檢測試劑盒(BD Biosciences公司，美國)；RIPA裂解液 ( Thermo 公司，美國)；ACTIN (CST公司，美國)；AKT(CST公司，美國)；p-AKT(CST公司，美國)；STAT3(CST公司，美國)；p-STAT3 (CST公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng) 人結腸癌細胞株HCT116(American type culture collection,ATCC)，培養(yǎng)于10% 胎牛血清培養(yǎng)基 (10%FBS RPMI-1640)含1% 雙抗，37 ℃培養(yǎng)箱 (5% CO2)，培養(yǎng)4 h后貼壁生長。當細胞處于對數(shù)生長期時，0.05%胰蛋白酶消化貼壁細胞，1/4傳代備實驗使用。

1.3 生物信息學分析 利用 TCGA 等數(shù)據(jù)庫的結腸癌數(shù)據(jù)及近年來(2015-2018年)的結腸癌組織樣本，分析HSP90的基因(HSP90AA1)表達情況，包括正常組42例，結腸癌組478例，基于Log2(RSEM+1)分析數(shù)據(jù)。

1.4 MTT細胞活性檢測 取對數(shù)生長期的HCT116細胞，胰蛋白酶消化后接種于3個96孔板，培養(yǎng)過夜，細胞貼壁后，分別給予0、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5 μM/L的SNX2112處理，3個孔板分別孵育24、48、72 h后吸去上清，每孔加20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清，每孔加入150 μL DMSO溶解液,置搖床上低速振蕩10 min，在酶標儀 (Molecular Devices公司，美國)490 nm處測量各孔的吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測凋亡 用胰酶消化HCT116細胞按2×105密度每孔接種于六孔板上，24 h后用0、0.04、0.08、0.16μM/L的SNX2112進行處理?；赩-FITC/PI檢測試劑盒說明書進行實驗。收集細胞，用冷PBS洗滌2次，并輕輕重懸于100 μL結合緩沖液中，然后用膜聯(lián)蛋白V-FITC(5 μL)和PI(10 μL)溶液染色，孵育15 min，并在流式細胞儀(BD 公司，美國)上進行分析。進行一式3份的實驗。

1.6 細胞周期測定 用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HCT116細胞，按每孔2×105細胞密度接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后，給予0、0.04、0.08、0.16 μM/L的SNX2112處理，孵育24 h后，收集細胞到離心管中，離心去上清后用PBS重懸，再次離心去上清，用預冷70%的乙醇4 ℃固定2 h；離心去上清，并用PBS重懸，再次離心去上清，每管加入0.5 mL碘化丙啶染色液重懸，37 ℃避光溫浴30 min,用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 劃痕實驗 將每孔1×106密度HCT116細胞接種于6孔板，貼壁后用10 μL槍尖在孔板中間劃一條直線，并用馬克筆標記，去除培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入1%FBS RPMI-164，分為SNX2112：0、0.04、0.08、0.16 μM/L 4個組，分別于0、24、48 h拍照。重復3次。Image J計算遷移面積。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測 將每孔2×105密度HCT116細胞接種于6孔板，貼壁后給予0、0.04、0.08、0.16 μM/L的SNX2112處理，孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，每孔加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液200 μL，用細胞刮將細胞全部刮下后置于離心管中，冰上靜置30 min后離心取上清，BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo公司，美國) 檢測蛋白濃度，95 ℃作用3 min使蛋白變性。配膠后上樣，電泳，轉膜，5%BSA封閉，一抗過夜，用 TBST 緩沖液 (Tris-Buffer Saline and Tween20，TBST) 洗膜后敷二抗常溫1 h，TBST洗膜后滴加ECL發(fā)光液，使用ChenmiDocMP成像分析儀進行曝光。

2 結果

2.1 HSP90在結腸癌中的差異表達 TCGA數(shù)據(jù)庫分析了一共520例結腸癌組織樣本數(shù)據(jù)(包括正常組42例，結腸癌組478例)，發(fā)現(xiàn)HSP90AA1在結腸癌中的表達上調(diào)(見圖1)。

使用TCGA RNA- Seq數(shù)據(jù)進行分析，正常組42例，結腸癌組478例。 圖1 HSP90AA1在結腸癌腫瘤組織及鄰近正常組織中的表達水平

2.2 SNX2112對 HCT116 細胞活力的影響 不同濃度的SNX2112作用于HCT116后，MTT 檢測結果顯示，與0 μM/L SNX2112組相比，加藥組尤其是高濃度SNX2112組的細胞活力明顯減小，SNX2112抑制HCT116細胞活性有明顯的時間-濃度依賴性。相同時間不同濃度SNX2112組之間差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，并且結果顯示時間越長SNX2112對腫瘤細胞的細胞活力抑制越明顯(見圖2)。Graphpad Prism 6計算IC50值24、48、72 h分別為：24.26、0.02613、0.035 94 μM/L。

A:IC50 24 h:24.26μM/L；48 h:0.02613μM/L； 72 h:0.03594μM/L；B:MTT檢測不同濃度SNX2112(0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50μM/L )分別給藥24、48、72 h后HCT116細胞存活率。圖2 SNX2112對結腸癌細胞株活力的影響

2.3 SNX2112阻滯HCT116細胞周期 進一步研究SNX2112對HCT116細胞周期的影響，流式細胞術結果顯示，與不加藥組(0μM/L組) 相比，給予SNX2112 0.08μM/L和0.16μM/L時，G2期HCT116細胞比例明顯升高(見圖3A)，并且具有統(tǒng)計學意義(見圖3B)，低濃度0.04μM/L也會增加細胞G2期，但未達到統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 SNX2112誘導HCT116細胞的凋亡 PI和Annexin V染色提示，與不加藥組(0μM/L組)相比，0.04、0.08、0.16μM/L均可不同程度的促進腫瘤細胞凋亡，隨著加藥劑量增加，凋亡細胞所占總細胞數(shù)百分比明顯上升(P<0.001，見圖4 A、B)。

A：采用PI (y軸)和Annexin V (x軸)染色流式細胞術檢測細胞凋亡，SNX2112在不同濃度處理HCT116細胞24 h；B：統(tǒng)計3次重復實驗的結果，給藥分別為0.00、0.04、0.08、0.16 μM/L時，3次實驗凋亡細胞的平均比例分別為(7.41±0.80)%、(12.9±3.25)%、(50.87±6.96)%、(75.73±2.49)%。圖4 SNX2112對結腸癌細胞的促凋亡作用

2.5 SNX2112抑制HCT116細胞遷移 細胞在低濃度血清1 640培養(yǎng)基(1%FBS RPMI-1640)培養(yǎng)下，在不同濃度的SNX2112作用后，分別于0、24、48 h拍照，高濃度SNX2112(0.08、0.16 μM/L)在培養(yǎng)48h后遷移面積與0h，0μM/L組對比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5A、B)。

A：分別為不同濃度SNX2112(0.00、0.08、0.16μM/L)在給藥0、24、48h的照片；B.統(tǒng)計3次重復實驗的結果。圖5 不同濃度SNX2112對HCT116細胞遷移的影響

2.6 不同濃度SNX2112 24 h對結腸癌信號蛋白STAT3、AKT及磷酸化水平檢測 采用 Western Blot對結腸癌相關蛋白檢測。不同濃度SNX2112給藥24 h后對細胞內(nèi)STAT3/AKT及磷酸化水平檢測。結果顯示，隨著給藥濃度的增加，上述蛋白表達隨之降低(見圖6)。0.04 μM/LSNX2112組(0.75±0.07 vs 1±0.12，P<0.05)、0.08 μM/LSNX2112組(0.43±0.05 vs 1±0.12，P<0.01)和 0.16 μM/L組(0.34±0.02 vs 1±0.12，P<0.01)腫瘤中p-STAT3分子的表達水平均明顯低于未給藥組(1±0.12)。與未給藥組(1±0.08)相比，0.08 μM/L SNX2112組(0.76±0.07 vs 1.00±0.08，P<0.05)和0.16 μM/LSNX2112組(0.55±0.05 vs 1.00±0.08，P<0.01)中STAT3分子的表達水平均顯著降低，而0.04 μM/L組(1.01± 0.08 vs 1.00±0.08，P=1.00)差異無統(tǒng)計學意義。0.16 μM/L SXN2112組p-AKT表達量較未給藥組明顯降低(0.38 ± 0.02 vs 0.65 ± 0.03,P< 0.05)。AKT各組間差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

在我國結腸癌發(fā)生率以平均每年4%～5%的增速逐年增加，傳統(tǒng)的治療方法除手術以及化療以外，分子靶向藥物的應用極大改善了結直腸癌患者的預后，總生存期由過去的6～12月延長至近30月[12]。選擇腫瘤細胞特異的靶點，應用針對該靶點的藥物進行治療，從而避免對正常細胞的傷害，取得高效低毒副作用的治療模式，越來越被腫瘤治療者所認同。HSP90抑制劑的發(fā)展從具有毒性的格爾德霉素，到藥理特性受限的17-AAG，再到具有較強水溶性的17-DMAG(阿螺旋霉素)、IPI-504(瑞他霉素)以及其他具有更完善特性的新型合成小分子，其抗腫瘤的潛在價值也顯得越來越突出。SNX-2112是一種結構新穎可口服的選擇性HSP90抑制劑，具有廣泛的抗腫瘤活性[13]。

既往研究表明，HSP90在多種癌癥中過表達，包括乳腺癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤和白血病。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的結腸癌基因表達數(shù)據(jù)進行分析，證實HSP90基因HSP90AA1在結腸癌中的表達遠高于正常組織，這意味著HSP90抑制劑在結腸癌中可能是一種有效的抗癌治療。HSP90有400多個客戶蛋白，包括激酶如AKT、CDKs、PKC以及轉錄因子等。AKT可以通過對下游多種途徑對靶蛋白進行磷酸化從而發(fā)揮抗凋亡作用，例如磷酸化Bcl-2、磷酸化P53等對細胞凋亡、周期等進行調(diào)控。在腫瘤中，STAT3可以靶向Bcl-2、Bcl-X等抗凋亡基因，增殖相關蛋白Cyclin D1、Myc等從而延長細胞的生存周期，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。為了進一步證明SNX2112對下游蛋白的作用，我們選擇用Western blot方法檢測具有代表性的蛋白AKT、STAT3及其磷酸化蛋白的表達。實驗結果顯示，SNX2112作用于腫瘤細胞 24h 后，細胞內(nèi)AKT、STAT3及其磷酸化蛋白的表達隨SNX2112濃度增加而逐漸降低。

綜上所述，本研究表明SNX2112不僅可以促進HCT116細胞凋亡，還能抑制其遷移能力并且可以在G2期對細胞周期阻滯。SNX2112的抗腫瘤效應與HSP90的客戶蛋白降解、活性降低有關，并且HSP90的多種客戶蛋白都在腫瘤通路中具有促進細胞生長、抑制凋亡的作用，所以SNX2112能夠靶向多個通路多個靶點，具有更廣泛的抗腫瘤效應，它會導致除STAT3、AKT之外的其他癌蛋白的降解，從而使抗癌或抑癌效應逐級放大，由此可見，SXN2112是一種很有臨床應用前景的抗癌藥物。但其抑制劑SNX2112對其余下游蛋白的抑制及其完全的作用機制還需進一步的研究。