敖弟書，徐運娥，孫 欣，宋 鴻

(遵義醫(yī)科大學 微生物學教研室，貴州 遵義 563099)

傳染病嚴重威脅著公共衛(wèi)生健康，在引起傳染病的病原體中，來自人畜共患或媒介傳播的病毒是最主要的[1]。病毒性疾病不但傳染性強、流行性廣，而且目前還沒有特效藥物治療。病毒除了引起急性感染之外，還可以引起持續(xù)性感染，某些病毒甚至與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關[2-3]。因此，對病毒生物學性狀、致病性和抗病毒藥物的研究已成為醫(yī)學和生命科學關注的熱點。然而，病毒因缺乏能量代謝或蛋白質合成所需的遺傳信息，只能在活細胞中生長，因此不能在體外無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，分離培養(yǎng)較困難。常選用相應的容納細胞、敏感動物或雞胚進行分離與鑒定，分離培養(yǎng)出相應病毒是病毒性疾病病原學診斷的金標準，其中細胞培養(yǎng)是最常用的病毒分離、鑒定和研究方法[4]。

在體外研究病毒多采用細胞培養(yǎng)法，傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)常用玻璃或塑料培養(yǎng)瓶或板進行，此為二維(Two dimensional,2D)平面，常常無法模擬具有立體空間結構的細胞微環(huán)境——細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)與細胞之間的相互作用，許多從組織分離進行二維培養(yǎng)的細胞會逐步失去分化表型[5]。近年來人們逐漸認識到，細胞外微環(huán)境中ECM、各種細胞因子等多種信號參與調節(jié)了細胞生長、增殖、分化和凋亡等生命活動[6]。為了能盡量模擬體內微環(huán)境，細胞培養(yǎng)技術進行了不斷的改革與創(chuàng)新，多種三維(Three dimensional,3D)培養(yǎng)模型被報道出來，它們在腫瘤細胞體外研究、組織工程和再生醫(yī)學中得到了廣泛的應用[7]。近年來有學者將三維細胞培養(yǎng)模型應用于病毒的分離培養(yǎng)取得了成功[8-9]，并觀察到3D細胞培養(yǎng)的感染效率高于2D細胞培養(yǎng)[8-9]。然而，對于3D病毒分離培養(yǎng)，至今依然沒有一個標準的模型。

目前所獲得的關于病毒復制增殖、致病性和藥物篩選等的知識多來源于二維細胞培養(yǎng)和動物實驗模型，然而，體內組織細胞生活在具有三維立體空間結構的微環(huán)境中，傳統(tǒng)二維培養(yǎng)方法不能反映微環(huán)境對病毒感染發(fā)生、發(fā)展的影響，因此建立病毒三維細胞培養(yǎng)模型，模擬體內病毒感染的微環(huán)境有助于深入研究病毒感染的機制及病毒與宿主之間的相互關系。水凝膠因大量含水不但能很好地給細胞提供營養(yǎng)，還能調節(jié)細胞的生長與分化，從而能模擬體內細胞生長的微環(huán)境，且具有可塑性高、臨床應用方便等特點[10]，被廣泛用作三維細胞培養(yǎng)的支架材料。膠原蛋白在人體內含量豐富，因是天然材料免疫排斥反應小，且具有良好的生物相容性，可自組裝形成膠原纖維網絡水凝膠，因而是三維培養(yǎng)常用的支架材料。我們課題組已成功建立了多種細胞體外納米自組裝短肽和膠原水凝膠三維培養(yǎng)模型[11-12]。因此，本實驗擬將病毒學技術與膠原水凝膠3D細胞培養(yǎng)技術相結合，建立膠原水凝膠293T細胞腺病毒三維培養(yǎng)模型，觀察三維培養(yǎng)與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)條件下病毒的增殖情況，為病毒性疾病的研究及抗病毒藥物篩選和疫苗的研發(fā)提供新的理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 293T細胞系購自武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心；腺病毒(空載體，帶EGFP)購自上海吉凱基因科技有限公司；I 型鼠尾膠原(Collagen I)購自美國 BD 公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國 Gibco 公司;鈣黃綠素 AM購自美國 Sigma 公司;MTS購自美國Promega 公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購于天根科技有限公司，qPCR試劑盒購于Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡表征膠原水凝膠 在冰浴中將1型鼠尾膠原稀釋為終濃度1.5 mg/mL，然后用NaOH調節(jié)pH為7.2，取100 μL置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min，待膠原形成凝膠后用2.5﹪戊二醛前固定，再梯度脫水，然后進行臨界點干燥、貼樣，離子濺射儀鍍膜后掃描電鏡(日本日立 SU8010 型掃描電鏡)觀察。

1.2.2 三維細胞培養(yǎng) 293T細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)置于CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。待細胞鋪滿90%后用0.05%胰酶消化，用預冷培養(yǎng)液制備細胞懸液,在冰浴中用3 mg/mL 1型鼠尾膠原(pH為7.2)溶液75μL與細胞懸液75 μL按1∶1充分混勻接種于24孔板(每孔5 × 104個細胞),置37 ℃培養(yǎng)箱30 min待膠原水凝膠成膠后每孔補加400 μL完全培養(yǎng)液，隔天換液，觀察記錄細胞生長情況。如需用96孔板進行細胞培養(yǎng)，則每孔25μL 3 mg/mL 1型鼠尾膠原(pH為7.2)溶液與25 μL細胞懸液混勻接種(每孔1.67 × 104個細胞)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。

1.2.3 MTS 測定細胞增殖情況 將293T細胞三維培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板。分別在1、3、5、…… 29 d取6個復孔加入MTS 20 μL，孵育2 h后用490 nm波長測定吸光度值。

1.2.4 染色觀察三維細胞增殖情況 24孔板三維培養(yǎng)293T細胞，分別在7、14、21、28 d用鈣黃綠素-AM(Ca-AM)染色后熒光顯微鏡觀察細胞活性。

1.2.5 三維病毒培養(yǎng)模型的建立及檢測 293T細胞三維培養(yǎng)于24孔板，24 h后用DMEM清洗細胞三次接種腺病毒，每孔接種4×106拷貝腺病毒，置37 ℃培養(yǎng)，24 h后吸出病毒液，再用DMEM清洗3次，加入完全培養(yǎng)液,感染后每天觀察、記錄感染情況。

1.2.6 MTS 測定病毒感染后細胞增殖情況 293T細胞三維培養(yǎng)于96孔板，24 h后感染腺病毒(1×106拷貝腺病毒每孔)，分別在感染后1、3、5、…… 27 d取6個復孔加入MTS 20 μL，孵育2 h后490 nm波長測定吸光度值。

1.2.7 透射電鏡觀察腺病毒在3D培養(yǎng)293T細胞中的增殖情況 收集24孔板內腺病毒感染7 d后的三維培養(yǎng)細胞(水凝膠及細胞)用于透射電鏡觀察。三維培養(yǎng)水凝膠用1%鋨酸于4 ℃下固定3 h，乙醇梯度脫水，Spurr樹脂浸透包埋，超薄切片(厚度70 nm)，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，JEM1230 型透射電鏡(JEOL，Japan)在80 kV加速電壓下檢查樣本。

1.2.8 實時熒光定量PCR觀察病毒增殖情況 293T細胞三維培養(yǎng)于96孔板,接種后24 h感染腺病毒(1×106拷貝腺病毒每孔),分別在感染后1、3、5、…… 27 d收集細胞及上清保存于-20 ℃。使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(天根DP315)根據說明書提取病毒DNA，使用BIO-RAD qPCR試劑盒進行擴增(引物為腺病毒標記EGFP:5’-TTCAAGATCCGCCACAACA-3’和5’- CGCTTCTCGTTGGGGTC-3’)。反應體系為20 μL，擴增條件為 95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 39個循環(huán)，65 ℃～95 ℃溶解曲線，每次擴增設置陰性(水)和陽性(腺病毒標準品)對照。反應結束后系統(tǒng)自動生成標準曲線，計算出對應樣品中完整病毒基因組的拷貝數。

1.2.9 三維擴增病毒感染性測定 三維腺病毒感染7 d后收集上清(PCR擴增定量后用1×106拷貝)再感染二維培養(yǎng)293T細胞，分別在感染后2、4、6 d收集上清及細胞，提取DNA后進行PCR擴增。

2 結果

2.1 掃描電鏡表征膠原水凝膠支架材料的結構特征 1型鼠尾膠原為溫敏型水凝膠，在0 ℃為液體，37 ℃時可自組裝成纖維形成水凝膠。SEM可見1型鼠尾膠原自組裝成高度交叉鏈接的膠原纖維，這些纖維彼此纏繞形成3D網絡(見圖1)。由此可見膠原水凝膠可作為三維培養(yǎng)支架進行細胞3D培養(yǎng)。

圖1 膠原水凝膠在SEM下的結構特征

2.2 膠原水凝膠三維培養(yǎng)中293T細胞的增殖情況 二維培養(yǎng)時，293T細胞4～6 h開始貼壁，18～24 h完全貼壁呈單層扁平多形態(tài)生長，細胞生長鋪滿瓶底后部分會重疊生長，逐漸脫落，不能長時間培養(yǎng)。而膠原水凝膠三維培養(yǎng)中細胞剛開始為分散的單個細胞，經3 d左右分裂生長形成細胞微球體，細胞微球體隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，呈球形或近似球形(見圖2)。細胞微球體增殖活性較好，從第3天開始快速增殖，13 d達高峰，之后增殖逐漸減少，28 d依然能見少量活細胞(見圖3、4)。這些結果表明三維培養(yǎng)細胞生長形態(tài)與二維培養(yǎng)不同，且能長時間培養(yǎng)，這類似于細胞在體內微環(huán)境下的生長情況，因而可用于長時間模擬體內微環(huán)境的體外研究。

圖2 293T細胞在2D和膠原水凝膠3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的形態(tài)

圖3 膠原水凝膠中293T細胞感染腺病毒前后的增殖活性

BF：293T細胞在膠原水凝膠3D培養(yǎng)體系中不同時間的相差圖，細胞形成微球體生長，隨著培養(yǎng)時間延長，球體逐漸增大，開始球體表面光滑，隨著培養(yǎng)時間增加，球體表面開始出現凸起等改變，培養(yǎng)26～28 d，部分微球體開始溶解；Ca-AM：293T細胞在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中不同時間的熒光染色圖，綠色示活細胞。圖4 293T細胞在膠原水凝膠3D培養(yǎng)體系中的生長及活性分析

2.3 病毒在三維培養(yǎng)293T細胞中的增殖情況 為了能更直觀觀察腺病毒的增殖情況，我們用增強綠色熒光蛋白(EGFP)標記腺病毒。在二維培養(yǎng)中腺病毒感染293T細胞18～24 h開始出現熒光，48～72 h最強，此時細胞全部出現CPE，4～6 d逐漸壞死脫落，不能長時間培養(yǎng)；而在膠原水凝膠3D培養(yǎng)體系中，293T細胞感染腺病毒后60～72 h才能見熒光細胞團，且少和弱，初始熒光細胞團主要分布于水凝膠邊緣，隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增多明顯，在培養(yǎng)第7天時熒光細胞團多且明亮，之后逐漸減少，隨之又增加，如此反復多次。三維培養(yǎng)感染腺病毒的293T細胞微球體在6～9 d開始出現形態(tài)改變，能見少部分細胞團表面凹凸不平或少量細胞脫落，12～14 d少部分細胞微球體開始溶解，水凝膠內細胞團變少，部分變小，大小不均。19～21 d能見大部分細胞微球體溶解，26～28 d幾乎全部細胞團溶解，水凝膠內能見大量單個圓形細胞和細胞裂解碎片(見圖5)。為了便于觀察腺病毒感染三維培養(yǎng)293T細胞后的病理改變和細胞內增殖的病毒顆粒，本研究用透射電鏡進行了檢測，結果顯示293T細胞病變明顯，出現內質網擴張、線粒體腫脹、破裂等改變，在胞漿中能觀察到少量病毒顆粒，直徑60～90 nm(見圖6)。為明確病毒的增殖量，進一步進行了qPCR擴增定量檢測，結果顯示腺病毒在3D體系中呈多峰增殖，第7天峰值最高達3.09×108copies/mL，而后出現3次小高峰，分別是13、19和23 d。同時，為了排除腺病毒是否會在水凝膠中大量存留而影響實驗結果，我們對不含細胞的水凝膠進行了腺病毒感染分析，結果顯示，在水凝膠和上清液中未檢測到病毒DNA(見圖7A)。以上表明腺病毒能感染膠原水凝膠三維培養(yǎng)的293T細胞，并能在此三維培養(yǎng)模型中持續(xù)長時間增殖。

BF:膠原水凝膠3D培養(yǎng)293T細胞感染腺病毒后7、14、21、28 d的相差圖，隨著感染后培養(yǎng)時間的延長，細胞微球體出現凹陷、囊泡、溶解等改變，感染后28 d見大部分細胞微球體溶解，水凝膠中能見溶解后的單個細胞或細胞碎片；FF:帶EGFP的腺病毒感染3D培養(yǎng)體系中293T細胞的熒光圖，隨著感染時間延長，病毒增殖逐漸減少，但增殖持續(xù)時間較長。圖5 膠原水凝膠中293T細胞感染腺病毒后的形態(tài)特點及腺病毒增殖情況

箭頭所示為病毒顆粒，M：線粒體,ER:內質網。 圖6 TEM觀察膠原水凝膠3D培養(yǎng)體系中的病毒顆粒及細胞病變

2.4 膠原水凝膠三維培養(yǎng)體系中293T細胞感染腺病毒后的增殖活性 膠原水凝膠中293T細胞在感染腺病毒5 d后增殖活性逐漸減弱，第7天最低，此后呈現出逐漸增強而后減弱的趨勢，在第17天后細胞增殖活性持續(xù)降低(見圖3)。

2.5 膠原水凝膠三維培養(yǎng)體系中腺病毒復制子的感染性 如圖7B所示，此三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)增殖出的腺病毒顆粒可成功感染二維培養(yǎng)293T細胞，并能在此細胞中持續(xù)增殖，且增殖趨勢與標準品感染組一致(見圖7B)。

A:qPCR測量腺病毒在293T細胞3D培養(yǎng)物中的增殖情況;3D為三維腺病毒擴增；3D Medium為水凝膠感染腺病毒后擴增;B：qPCR測量三維擴增腺病毒的感染性;2D為二維標準腺病毒擴增;3D supernatants為三維腺病毒感染7 d后收集上清再感染二維293T細胞后收集上清及細胞PCR擴增。圖7 qPCR檢測腺病毒增殖情況

3 討論

本實驗使用的三維培養(yǎng)支架材料膠原水凝膠，是由自組裝的膠原纖維交聯形成的凝膠網絡，小分子物質可以自由進出，因而可使分散于水凝膠中的細胞都能獲得營養(yǎng)，且膠原蛋白為天然材料，免疫排斥反應小，因此膠原水凝膠具有良好的親水性和生物相容性，適合用作三維培養(yǎng)的支架材料[10]。本研究觀察到293T細胞能在膠原水凝膠中長時間良好生長，細胞分裂生長形成致密的多細胞球體，這與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)不同。由于3D培養(yǎng)系統(tǒng)通過提供可重現的、可控制的微環(huán)境來模擬生理條件，且易于操作、分析和成像，因此，3D細胞培養(yǎng)有望部分替代動物模型進行實驗研究[13]。細胞培養(yǎng)是病毒分離培養(yǎng)和鑒定常用的方法，3D病毒培養(yǎng)模型能部分代替動物模型模擬體內微環(huán)境用于病毒的研究，避免了動物對多數人類病毒不敏感、感染后癥狀不明顯和動物體內常帶有潛在病毒對研究的影響。

腺病毒直徑60～90 nm,理論上該病毒可以通過膠原水凝膠的支架孔隙感染293T細胞。本研究發(fā)現在膠原水凝膠三維培養(yǎng)體系中，293T細胞感染腺病毒7 d后透射電鏡下觀察到胞內病毒顆粒，這說明腺病毒已經通過膠原水凝膠支架孔隙感染了其內生長的293T細胞。在體內，病毒感染易感細胞并于胞內增殖釋放出大量子代病毒會再次感染周圍細胞，引起細胞病變和相應臨床癥狀。在體外二維培養(yǎng)時細胞呈單層平面生長，接種病毒后，病毒能在短時間內吸附于細胞表面，隨后穿入細胞大量增殖，病毒感染的細胞很快出現CPE，逐漸壞死、脫落，因而無法維持長時間培養(yǎng)研究。然而在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，單個細胞分裂后形成微球體生長，病毒通過細胞微球體表面受體吸附于其表面，首先感染微球體最外層細胞，于胞內復制擴增后釋放出大量子代病毒，復制子再感染微球體中心細胞或鄰近細胞團，而未被感染的細胞繼續(xù)分裂生長，因而在三維培養(yǎng)體系中病毒增殖時間比二維大大延長，早期觀察不到明顯的細胞微球體改變，且出現多個增殖峰的特點，這符合病毒感染體內細胞的增殖過程(即感染、釋放、再感染)。而這一研究結果與Ao、Chen和Berto等在病毒三維培養(yǎng)研究中的報道類似[8,14-15]，因此，與二維培養(yǎng)相比，病毒三維培養(yǎng)更能模擬體內病毒感染增殖的過程。但文獻中不同病毒在不同三維體系中出現增殖峰的時間和持續(xù)增殖時間有所差異，這可能與病毒自身的復制周期、宿主細胞的易感性或使用的三維培養(yǎng)材料不同等因素有關。

本研究以1型鼠尾膠原為三維支架材料成功構建了腺病毒體外三維培養(yǎng)模型，但不可否認，本研究中還存在一些不足。首先，雖然研究結果支持腺病毒可在膠原水凝膠293T細胞三維培養(yǎng)體系中持續(xù)長時間增殖，但由于使用的是腺病毒空載體，且沒有進一步進行病毒感染機制的研究，是否其他病毒也能在此三維培養(yǎng)體系中長期持續(xù)增殖還有待更多的研究證實；其次，隨著3D細胞培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展，研究者們清晰認識到支架材料的機械性能(如材料硬度、孔隙結構)和生化特性(如生物相容性、可降解性)對細胞的活力、黏附、分化、遷移等都可能產生重要影響[16]，雖然膠原本身是天然材料具有免疫排斥反應小、生物相容性好、可降解、力學性能好等優(yōu)點，但它依然存在孔隙不均勻、可能含有潛在病原體等問題；第三，三維培養(yǎng)不像二維培養(yǎng)細胞生長在同一平面，病毒感染后能觀察到明顯的CPE現象，如能在研究中測定病毒感染后每個細胞微球體的平均大小、密度和熒光強度的變化更能體現病毒的增殖特點?？傊?，機體是一個多細胞多器官多組織共存的復雜環(huán)境，病毒感染機體、在體內進行復制增殖、引發(fā)疾病等一系列病理過程，均不只有單一細胞參與，而是多細胞多組織共同參與的一個復雜的病理生理過程。因此，若能利用水凝膠構建出多種細胞的3D共培養(yǎng)模型，對于研究宿主與病毒之間的相互作用將有重要意義。

綜上所述，本研究成功構建了腺病毒體外三維培養(yǎng)模型，我們希望此模型能用于病毒性疾病致病機制、抗病毒藥物篩選和疫苗的研究。因腺病毒是常用的遺傳研究工具和基因載體，我們也希望此模型能用于基因治療等多個領域的研究。