周艷萌，向曉波，王 歡

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)仍然是世界大多數(shù)地區(qū)肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的主要病因，中國的肝細(xì)胞癌發(fā)病率居世界前列[1]。有絲分裂檢查點(diǎn)基因BUBR1(Mitotic checkpoint serine/Threonine kinase B)與酵母細(xì)胞Mad3同屬一個家族基因，其編碼的BUBR1蛋白是有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)(Spindle assembly checkpoint，SAC)基因中的重要組分，在染色體分離、招募有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合體成員和激活紡錘體檢查點(diǎn)等方面發(fā)揮著重要作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在約45%的HCC中BUBR1呈高表達(dá)；在BUBR1表達(dá)增高者中，大多數(shù)人的血清HBsAg呈陽性，BUBR1基因可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲或復(fù)發(fā)中起重要作用[3-4]。Kim等[5]的研究指出：BUBR1是有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合體(Mitotic checkpoint complex，MCC)的關(guān)鍵成分，是HBx病毒癌蛋白的靶點(diǎn)。HBx-BUBR1相互作用破壞了MCC中CDC20的結(jié)合，表達(dá)HBx的細(xì)胞經(jīng)歷了錯誤的有絲分裂過程。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15細(xì)胞對5-FU、ADM、Amn等化療藥物的敏感性明顯低于HepG2細(xì)胞，提示HBV感染與肝癌細(xì)胞對化療藥物耐藥的發(fā)展可能有一定關(guān)系[6-7]。本研究利用慢病毒載體和RNAi干擾技術(shù)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的BUBR1沉默載體，沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV全基因組的肝癌細(xì)胞HepG2.2.15的BUBR1基因，并篩選出穩(wěn)定沉默BUBR1基因的細(xì)胞株，為研究HBV所致肝細(xì)胞癌化療耐藥與BUBR1基因的關(guān)系提供一種新的實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2.2.15細(xì)胞株由遵義醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。293T細(xì)胞、大腸桿菌菌株DH5α、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G、表達(dá)質(zhì)粒phU6-CMV-GFP-puro (含氨芐霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因)shRNA載體購自上海吉凱基因公司。DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購自Hyclone公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和嘌呤霉素購于美國Invitrogen公司。質(zhì)粒提取試劑盒、TRNzol總RNA抽提試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takaya公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)BUBR1沉默載體 用AgeI、EcoRI兩種內(nèi)切酶對phU6-CMV-GFP-puro載體進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，然后回收目的片段。從GenBank中查找人BUBR1基因cDNA序列(NM_001211)，根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成3對靶點(diǎn)序列(大寫為引物序列，小寫為保護(hù)基因)：siRNA-1:5′-ccggccTCAGAAAGCATCACCTCAActcgagTTGAGGTGATGCTTTCTGAggttt-ttg-3′; siRNA-2:5′-ccggccAGTGTACCTTTCTCCATTTctcgagAAATGGAGAAAGGTACA-CTggtttttg-3′; siRNA-3:5′- ccgggaGACAACTAAACTGCAAATTctcgagAATTTGCAGTTT-AGTTGTCtctttttg-3′。同時合成RNAi陰性對照scrambled序列。以上序列分別進(jìn)行退火獲得雙鏈DNA，通過 T4 DNA 連接酶將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈 DNA 連接，將10 μL交換反應(yīng)產(chǎn)物加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化，用氨芐培養(yǎng)基篩選陽性菌落進(jìn)行測序，將測序正確的菌液轉(zhuǎn)接于10 mL含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，用天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.2 慢病毒的包裝 對數(shù)生長期的293T 細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×106細(xì)胞/15 mL，重新接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G和表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，PBS液清洗一次，加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h(轉(zhuǎn)染即可計(jì)為0 h)的293T細(xì)胞上清液，于4 ℃ 4 000 g離心10 min，收集上清液，并用 0.45 μm濾器過濾。將過濾后的病毒上清液以離25 000 rpm、4 ℃離心2 h，棄去上清，加入病毒保存液放-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒滴度檢測 病毒原液10 μL與無血清培養(yǎng)基90 μL進(jìn)行10-1～10-7梯度稀釋。胰酶消化293T細(xì)胞并調(diào)整濃度為 4×104個/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，吸棄90 μL原培養(yǎng)基，每孔加入90 μL稀釋好的病毒液，每個稀釋度3個復(fù)孔，感染24 h后每孔再加入100 μL完全培養(yǎng)液，48 h后觀察熒光表達(dá)情況，病毒滴度(TU·mL-1)=1 000×熒光細(xì)胞個數(shù)/每孔的病毒液量(μL)。

1.2.4 慢病毒感染HepG2.2.15及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 生長旺盛的HepG2.2.15細(xì)胞以2.5×104/孔接種24孔板，在37 ℃ 5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。第2天換含完全培養(yǎng)液并用收獲的病毒以MOI=1、10、100(病毒滴度：1×109TU/mL)每孔加入3 μL病毒，空白組加入等量完全培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組：1.空白對照組：HepG2.2.15細(xì)胞；2.陰性對照組：HepG2.2.15+慢病毒NC；3.實(shí)驗(yàn)組：①沉默1組：HepG2.2.15+ siRNA-1；②沉默2組： HepG2.2.15+siRNA-2；③沉默3組：HepG 2.2.15+ siRNA-3。感染12 h換為常規(guī)完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的HepG2.2.15細(xì)胞。傳代后換含嘌呤霉素終濃度3 μg/mL的培養(yǎng)基篩選，得到穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。

1.2.5 Real-time PCR檢測BUBR1沉默效果 收集上述各組細(xì)胞檢測BUBR1 mRNA的表達(dá)量，TRNzol抽提細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、總體系20 μL，采用SYBR Green染料進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參。引物序列：BUBR1基因：上游引物為5′-GCACCGACATTCCAAGCTC-3′；下游引物為5′-TGTGCTTCGTTGTGGTACAGA-3′；內(nèi)參β-actin：上游引物：5′- TCCTGTGGCATCCACGAA-3′；下游引物：5′- GAAGCATTTGCGGTGGAC -3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，57.5 ℃延伸10 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。實(shí)時熒光定量PCR檢測BUB1B在HepG2.2.15中的表達(dá)，BUBR1mRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct值表示[8]。

1.2.6 MTT法檢測沉默對細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞以濃度5×104個/mL細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL的DMSO溶解甲瓚顆粒，在酶標(biāo)儀波長492 nm下檢測各孔吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率[9]。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值 /對照組OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒測序鑒定 對3個干擾組重組載體陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果證明干擾載體中的特異性干擾序列完全正確(見圖1)，說明靶向BUBR1基因重組慢病毒載體phU6-CMV-GFP-puro構(gòu)建成功。

A:siRNA-1；B:siRNA-2；C:siRNA-3。圖1 重組慢病毒載體BUBR1shRNA測序鑒定結(jié)果

2.2BUBR1shRNA重組慢病毒包裝和滴度測定 測序鑒定正確的BUBR1shRNA重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光(見圖2)，說明BUBR1shRNA重組慢病毒轉(zhuǎn)染成功。根據(jù)鏡下熒光細(xì)胞個數(shù)和每孔病毒液的量計(jì)算病毒滴度約為10-9TU/mL。

A：正常293T細(xì)胞；B：包裝siRNA-1的293T細(xì)胞；C：包裝siRNA-2的293T細(xì)胞；D：包裝siRNA-3的293T細(xì)胞。圖2 熒光顯微鏡觀察包裝了重組慢病毒BUBR1 shRNA的293T細(xì)胞(標(biāo)尺：50 μm)

2.3 重組慢病毒BUBR1shRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞 制備成功的重組慢病毒BUBR1shRNA感染HepG2.2.15細(xì)胞，72h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，MOI=10條件下陰性對照組和各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)不受影響，轉(zhuǎn)染率均達(dá)80%以上。用嘌呤霉素篩選得到了穩(wěn)定的慢病毒感染細(xì)胞株(見圖3)。

A:空白對照組；B:陰性對照組；C:沉默1組；D:沉默2組；E:沉默3組(1.明場；2.熒光)。圖3 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒BUBR1shRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞(標(biāo)尺：50 μm)

2.4 Real-time PCR檢測BUBR1沉默效果 熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示沉默組3對shRNA靶點(diǎn)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，均顯著下調(diào)BUBR1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，組間比較差異具有顯著性(P<0.05)，沉默3組沉默效果最好；與空白對照組和陰性對照組比較差異也具有顯著性(P<0.01)。陰性對照組BUBR1mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上調(diào)，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

*:與空白對照組比較，P<0.01；#：與陰性對照組比較，P<0.01；&：沉默組組間比較，P<0.05。圖4 HepG2.2.15細(xì)胞中BUBR1 3個靶點(diǎn)沉默效率比較

2.5 MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的情況 利用MTT法觀察BUBR1沉默后對HepG2.2.15細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示陰性對照組作用24h對HepG2.2.15細(xì)胞具有短暫的促增殖作用，但是隨著感染時間的延長細(xì)胞的增殖明顯被抑制作用，與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；沉默組感染后24 h及48h對HepG2.2.15細(xì)胞也有促進(jìn)增殖的趨勢，與空白對照組比較有差異(P<0.05)，感染72 h對細(xì)胞增殖沒有影響，與空白對照組比較無差異(P>0.05，見表1)。

表1 BUBR1沉默對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響

3 討論

多種危險因素與肝癌的發(fā)生有關(guān)，慢性HBV感染是世界范圍內(nèi)HCC最重要的病因之一。BUBR1是有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)的一個關(guān)鍵組成部分，它可以通過阻斷染色體與紡錘體的正確連接來防止染色體分離錯誤[10]，近年來越來越多有關(guān)腫瘤方面的研究聚焦在這個重要的因子上。有研究[3]發(fā)現(xiàn)在HCC進(jìn)展中BUBR1呈過度表達(dá)，BUBR1可以作為估計(jì)HCC生物學(xué)特性的潛在腫瘤生物標(biāo)志物。在腫瘤的治療中，常通過抗癌藥物誘導(dǎo)基因損傷，激活細(xì)胞周期檢測點(diǎn)信號傳導(dǎo)通路，從而使細(xì)胞分裂停滯或者誘導(dǎo)其凋亡。但是，許多因素影響了腫瘤對化學(xué)藥物的敏感性，其中重要的因素之一就是檢測點(diǎn)成分表達(dá)異常所致的檢測點(diǎn)功能失常。因此，BUBR1在腫瘤治療中也倍受關(guān)注。以病毒為載體的轉(zhuǎn)染方法具有轉(zhuǎn)染率較高、基因表達(dá)時間較長等優(yōu)點(diǎn)。慢病毒是以人類免疫缺陷病毒I型(Human immunodeficiency virus-1，HIV-1)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種基因載體，它利用HIV能將自身基因組插入整合到宿主基因組的特性獲得病毒載體，再通過病毒載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素等抗性篩選后即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株[11]。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒成功構(gòu)建了phU6-CMV-GFP-puro-shRNA-BUBR1慢病毒干擾質(zhì)粒載體，測序證明干擾載體中的特異性干擾序列完全正確，利用該載體成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集到滴度約為10-9TU/mL病毒液，以此病毒液感染HepG2.2.15細(xì)胞后，陰性對照組及沉默各組均可以在熒光顯微鏡下檢測到綠色熒光，Real-time PCR證實(shí)沉默各組細(xì)胞中的BUBR1表達(dá)較空白對照組、陰性對照組顯著降低，說明構(gòu)建的載體病毒能有效沉默HepG2.2.15細(xì)胞中的目的基因，經(jīng)嘌呤霉素篩選2周獲得穩(wěn)定沉默BUBR1的HepG2.2.15細(xì)胞系。有研究提出在BUBR1表達(dá)增高者中大多數(shù)人的血清HBsAg呈陽性[3-4]，Lira等[12]研究也發(fā)現(xiàn)HPV感染可能與口腔鱗狀細(xì)胞中BUBR1的過度表達(dá)有關(guān)，說明有些病毒的感染可能會導(dǎo)致BUBR1的過度表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中陰性對照組BUBR1表達(dá)明顯高于空白對照組，說明慢病毒的感染可能會導(dǎo)致BUBR1的過度表達(dá)。不管使用哪種病毒載體，其MOI和最佳轉(zhuǎn)染時間都是非常重要的[13]。實(shí)驗(yàn)中篩選到的最佳MOI為10，在此MOI下陰性對照組和沉默組對HepG2.2.15細(xì)胞的形態(tài)均無明顯影響。沉默3個組的BUBR1基因沉默效果均很好，以第3組沉默效果最好。MTT結(jié)果提示沉默組對HepG2.2.15細(xì)胞的增殖沒有影響，沉默后24、48 h對細(xì)胞有一定促增殖作用；陰性對照組感染24 h也有短暫的促增殖，但是隨著時間的延長細(xì)胞的增殖被抑制，其原因可能是由于HepG2.2.15細(xì)胞是由HBV全基因組轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞而來[14]，當(dāng)慢病毒載體同時也插入細(xì)胞基因組中24h時慢病毒尚沒有進(jìn)行增殖，沒有影響HepG2.2.15細(xì)胞的增殖，隨著培養(yǎng)時間的延長，慢病毒也在細(xì)胞中增殖，但是最終是由于慢病毒的增殖影響HepG2.2.15細(xì)胞的增殖呢，還是HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBV相關(guān)抗原影響了細(xì)胞在增殖，還是二者共同作用影響了細(xì)胞的增殖呢？我們還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)?？傊覀兂晒⒘朔€(wěn)定沉默BUBR1的HepG2.2.15細(xì)胞系，可以為下一步研究HBV所致肝細(xì)胞癌對化療藥物耐藥性與BUBR1之間的關(guān)系提供一個工具。