蔣玲麗，魏在榮

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 燒傷整形外科， 貴州 遵義 563099)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因車禍傷、機(jī)器絞傷等導(dǎo)致周圍神經(jīng)損傷的患者數(shù)量高達(dá)百萬，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[1]。周圍神經(jīng)損傷(Peripheral nerve injuries，PNI)導(dǎo)致其支配區(qū)域的感覺及運(yùn)動(dòng)功能喪失，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。截至目前，臨床上治療PNI的方法主要有神經(jīng)斷端吻合術(shù)、自體神經(jīng)轉(zhuǎn)位或移植術(shù)、神經(jīng)套接管、組織工程材料、干細(xì)胞治療以及促神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射治療等。由于神經(jīng)顯微吻合術(shù)后易形成吻合口瘢痕或吻合不佳導(dǎo)致神經(jīng)斷端神經(jīng)瘤形成，神經(jīng)套接管以及組織工程材料價(jià)格昂貴、組織相容性不佳、療效不確定等因素，目前臨床修復(fù)神經(jīng)缺損最佳的治療方式仍然是自體神經(jīng)轉(zhuǎn)位或移植，但是自體神經(jīng)來源有限且神經(jīng)供區(qū)并發(fā)失神經(jīng)癥狀，所以，目前已有的治療方法在臨床仍存在很大應(yīng)用局限性[2-5]。所以，在臨床工作中迫切于尋找一種新的有效的周圍神經(jīng)修復(fù)方案。

PNI再生是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，隨著對(duì)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)PNI修復(fù)再生過程受到諸多關(guān)鍵因子及通路的調(diào)控，而了解這些因素的調(diào)控機(jī)制就很可能找到新的臨床治療靶標(biāo)，通過干預(yù)調(diào)控因素從而加速周圍神經(jīng)修復(fù)再生。因此，研究PNI修復(fù)過程中關(guān)鍵調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)理，針對(duì)神經(jīng)修復(fù)機(jī)制開發(fā)新型藥物，對(duì)提高PNI治療效果及改善患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

1 PNI修復(fù)再生過程

PNI再生主要經(jīng)歷了神經(jīng)斷端華勒變性、修復(fù)雪旺細(xì)胞形成和“神經(jīng)橋”形成三個(gè)重要過程(見圖1)。

圖1 PNI主要修復(fù)過程及miRNA的調(diào)控作用

1.1 華勒變性 華勒變性是PNI修復(fù)再生的基礎(chǔ)[6]。周圍神經(jīng)損傷后不久，神經(jīng)遠(yuǎn)節(jié)斷端由于喪失胞體營(yíng)養(yǎng)支持而變性、解體，髓鞘及軸突破壞，即發(fā)生華勒變性。此時(shí)清除損傷部位的髓鞘及軸突碎片刻不容緩，順利清除髓鞘及軸突碎片可以為軸突再生創(chuàng)造合適的微環(huán)境，而碎片清除不佳則可能觸發(fā)炎癥性免疫反應(yīng)，從而損害神經(jīng)元以及延緩軸突再生過程。在華勒變性過程中，神經(jīng)斷端雪旺細(xì)胞 (Schwann cells,SC)將在分子及細(xì)胞水平發(fā)生廣泛的變化，產(chǎn)生獨(dú)特的表型，即形成修復(fù)雪旺細(xì)胞[7]。修復(fù)雪旺細(xì)胞是一種具有較強(qiáng)再生能力的祖細(xì)胞樣細(xì)胞，主要有維持受損神經(jīng)活性、支持神經(jīng)再生等功能[8-10]。修復(fù)雪旺細(xì)胞形成后通過在局部以引發(fā)髓鞘自噬、募集巨噬細(xì)胞等方式清除髓鞘及軸突碎片[8]，聯(lián)合損傷部位的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等形成引導(dǎo)軸突再生的“神經(jīng)橋”(Bungs of Büngner)，引導(dǎo)軸突重新支配靶目標(biāo)同時(shí)表達(dá)諸多關(guān)鍵的再生相關(guān)細(xì)胞因子，例如神經(jīng)元生長(zhǎng)因子(Neuronal growth factors)和細(xì)胞粘附因子(Cell adhesion molecules)[8,11]，為軸突再生創(chuàng)造適宜的微環(huán)境。

1.2 修復(fù)雪旺細(xì)胞形成 修復(fù)雪旺細(xì)胞的形成受諸多機(jī)制的調(diào)節(jié)，主要是與髓鞘形成相關(guān)基因的下調(diào)和損傷特異性基因表達(dá)程序的上調(diào)。未成熟的雪旺細(xì)胞向有髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取決于前髓鞘素基因調(diào)節(jié)蛋白(Promyelin gene regulatory proteins)，包括Krox-20、Nab1和2、Oct-6、Brn2、NFκB和Sox-10等，而雪旺細(xì)胞髓鞘化主要取決于鋅指轉(zhuǎn)錄因子Krox-20(Egr2)和其他一些軸突信號(hào)激活的前髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子[12-15]。髓鞘形成的雪旺細(xì)胞有很強(qiáng)的可塑性，在神經(jīng)受損或者發(fā)生脫髓鞘病變時(shí)，它可以去分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞，在此過程中，亮氨酸拉鏈蛋白c-Jun作為主要調(diào)控者[13]。在正常生理過程中，c-Jun通過Krox-20或環(huán)磷酸腺苷(cAMP )抑制髓磷脂基因的活化，當(dāng)神經(jīng)損傷時(shí)，c-Jun和Krox-20表現(xiàn)出交叉拮抗功能關(guān)系，調(diào)控有髓雪旺細(xì)胞去分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞[10]。c-Jun存在于未成熟的雪旺細(xì)胞中，其表達(dá)被Krox-20抑制，而在共培養(yǎng)過程中過表達(dá)c-Jun時(shí)髓鞘化受到抑制，因此在雪旺細(xì)胞開始髓鞘化時(shí)c-Jun的表達(dá)水平很低。PNI后雪旺細(xì)胞去分化重新進(jìn)入細(xì)胞周期，c-Jun及磷酸化c-Jun的表達(dá)迅速上調(diào)，雪旺細(xì)胞表現(xiàn)為去分化及增殖；而當(dāng)外源性使用db-cAMP誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞髓鞘化時(shí)，c-Jun和磷酸化c-Jun被抑制[16-17]。所以在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中，c-Jun首先上調(diào)以促斷端SC去分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞并增殖，隨著修復(fù)進(jìn)程的進(jìn)行，c-Jun下調(diào)，而Krox-20等促雪旺細(xì)胞髓鞘化因子開始上調(diào)，促雪旺細(xì)胞髓鞘化進(jìn)而促進(jìn)PNI修復(fù)。

1.3 “神經(jīng)橋”形成 在“神經(jīng)橋”形成前，兩斷端之間神經(jīng)碎片的清除十分必要，而巨噬細(xì)胞在這個(gè)過程中扮演著“清道夫”的作用，主要功能是參與髓鞘及軸突碎片的清除，促進(jìn)神經(jīng)橋形成。PNI后，局部微環(huán)境缺氧刺激以及去分化SC募集到損傷局部的巨噬細(xì)胞聯(lián)合局部常駐巨噬細(xì)胞[18]對(duì)PNI迅速做出反應(yīng)[19-21]。CCL2是單核細(xì)胞的主要趨化因子，它與受體CCR2以高親和力結(jié)合[22-23]，在神經(jīng)中，CCL2主要在雪旺細(xì)胞中表達(dá)，CCR2主要在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，而巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在清除髓磷脂和軸突碎片中起主要作用[24]。神經(jīng)損傷后，在損傷局部檢測(cè)到CCL2 mRNA增加，隨后在整個(gè)神經(jīng)遠(yuǎn)端殘根中高表達(dá)，隨著雪旺細(xì)胞高表達(dá)CCL2，巨噬細(xì)胞不斷被募集到損傷局部，并于3天左右達(dá)到峰值。巨噬細(xì)胞對(duì)髓磷脂的吞噬清除主要是調(diào)理素途徑CR3(補(bǔ)體受體3)和非調(diào)理素途徑SRA(清道夫受體-AI / II)[6]：變性的髓磷脂激活補(bǔ)體系統(tǒng)后產(chǎn)生補(bǔ)體蛋白C3bi后，CR3可通過C3bi與C3bi調(diào)理過的髓磷脂結(jié)合，從而清除變性的髓磷脂，而SRA作為非調(diào)理素受體，可直接結(jié)合未經(jīng)調(diào)理的髓磷脂對(duì)髓磷脂進(jìn)行清除。據(jù)近期研究，CX3CR1依賴性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷神經(jīng)中，釋放出含有可產(chǎn)生活性氧的酶的外泌體，神經(jīng)元軸突內(nèi)吞并將這些外泌體逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)膠質(zhì)，在神經(jīng)元細(xì)胞體釋放出活性氧，這些分子氧化并使磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)失活，從而激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號(hào)通路(Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway)，由此促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生[25]。另外，在秀麗隱桿線蟲中，在巨噬細(xì)胞上表達(dá)基因ced-1(ced代表細(xì)胞死亡異常)編碼一種跨膜清除劑受體(該受體在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間高度保守)，當(dāng)死亡細(xì)胞或軸突碎片發(fā)出吞噬信號(hào)時(shí)，巨噬細(xì)胞表面受體激活后啟動(dòng)信號(hào)通路對(duì)軸突碎片等“垃圾”進(jìn)行清除[26]。

PNI后神經(jīng)兩斷端之間形成的“神經(jīng)橋”(“Bungs of Büngner”)是引導(dǎo)軸突再生重新支配靶組織的橋梁。PNI后，神經(jīng)斷端SC去分化為祖細(xì)胞樣細(xì)胞，發(fā)出信號(hào)募集血液中巨噬細(xì)胞至損傷部位，同時(shí)局部常駐巨噬細(xì)胞激活，巨噬細(xì)胞感受到損傷局部的缺氧信號(hào)。在PN橫斷第2天左右，損傷部位巨噬細(xì)胞(50%)和嗜中性白細(xì)胞(24%)以及成纖維細(xì)胞(13%)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)(5%)初步形成一個(gè)半透明的“神經(jīng)橋”[19]。巨噬細(xì)胞分泌的VEGF-A誘導(dǎo)形成的極化血管是周圍神經(jīng)再生過程中引導(dǎo)SC及軸突準(zhǔn)確重支配靶目標(biāo)的基礎(chǔ)[27]。為了緩解局部缺氧，神經(jīng)橋巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α表達(dá)增加并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，上調(diào)促血管生成因子(例如VEGF-A)，而VEGF是ECs強(qiáng)烈有效的引誘劑，故橋中巨噬細(xì)胞通過分泌VEGF-A，能夠使ECs聚集到兩神經(jīng)斷端，觸發(fā)神經(jīng)橋區(qū)域的血管極化，進(jìn)而形成神經(jīng)橋極化血管內(nèi)皮支架，該支架可以引導(dǎo)雪旺細(xì)胞索從神經(jīng)殘端以“出芽”的方式爬出，并有方向性的穿過神經(jīng)橋。研究證實(shí)TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)與SC增殖、凋亡和髓鞘形成的調(diào)節(jié)有關(guān)[28]，在雪旺細(xì)胞沿神經(jīng)橋遷移過程中，TGFβ通過上調(diào)EphB2而介導(dǎo)EphB2效應(yīng)物N-鈣粘蛋白(它也是TGFβ靶標(biāo))的表達(dá)，從而使雪旺細(xì)胞索能沿著神經(jīng)橋定向移動(dòng)，而在缺乏TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)的情況下，N-鈣粘蛋白表達(dá)降低將會(huì)導(dǎo)致SC索及其伴隨再生的軸突混亂遷移，導(dǎo)致周圍神經(jīng)修復(fù)重建失敗。雪旺細(xì)胞索沿神經(jīng)橋爬行后形成一個(gè)中空的管腔，再生軸突沿著這條管腔再生，最終準(zhǔn)確重支配其靶目標(biāo)。

2 miRNA在PNI修復(fù)中的作用

miRNA在PNI修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[29](見圖1)。研究發(fā)現(xiàn)PNI后miR-340通過直接靶向組織纖溶酶原激活劑(tPA，有降解基質(zhì)分子和細(xì)胞粘附分子的能力)的3'-UTR以調(diào)控tPA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞碎片的清除及軸突再生[30]。PNI后軸突或神經(jīng)末梢分泌出大量miRNA指導(dǎo)雪旺細(xì)胞的遷移， miR-9，miR-221，miR-222和miR-182可以調(diào)節(jié)SC的增殖和遷移，其中miR-221-3p通過下調(diào)SCs髓鞘形成所必需的NGF1-A結(jié)合蛋白1(Nab1)，抑制SCs髓鞘形成而促進(jìn)SCs的增殖及遷移[31]；miR-221 / 222可顯著促進(jìn)PNI后髓鞘再生過程以促進(jìn)神經(jīng)再生[32]。PNI后周圍神經(jīng)miR-222通過部分沉默PTEN的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突向外生長(zhǎng)[33]；Let-7 miRNA通過直接靶向神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)并抑制其蛋白翻譯，從而顯著降低SCs的細(xì)胞增殖和遷移，而在PNI的早期應(yīng)激反應(yīng)中l(wèi)et-7 miRNA通過非NGF依賴途徑抑制SC凋亡[34]。miR-138是神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)的miRNA，其作為分子阻遏物來調(diào)節(jié)發(fā)育和再生過程中軸突的生長(zhǎng)，而NAD依賴的組蛋白脫乙?；?HDAC)SIRT1為miR-138下游的分子靶標(biāo)，SIRT1又作為轉(zhuǎn)錄阻遏物直接抑制miR-138的表達(dá)從而促進(jìn)哺乳動(dòng)物軸突再生，故miR-138和HDAC SIRT1之間形成相互負(fù)反饋的回路調(diào)控軸突再生過程[35]。miR-192-5p抑制作用通過上調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡并增加神經(jīng)修復(fù)因子的表達(dá)以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生[36]。PNI后上調(diào)miR-sc14可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖和遷移，所以有研究提出miR-sc14可能是促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的干預(yù)靶標(biāo)[37]。

3 外泌體miRNA在PNI修復(fù)中的作用

近年來，越來越多研究表明外泌體在細(xì)胞間通訊中起到關(guān)鍵作用，外泌體[38-40]及其內(nèi)富含的miRNA參與調(diào)控多種細(xì)胞途徑，包括血管生成，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞凋亡等過程[41-42]。研究表明外泌體攜帶的miRNA在神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用[43](見圖2)。在PNI修復(fù)過程中，微環(huán)境中的雪旺氏細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stromal cells，MSCs)等細(xì)胞會(huì)通過外泌體攜帶的miRNA加速周圍神經(jīng)損傷修復(fù)，促進(jìn)周圍神經(jīng)功能恢復(fù)[43-44]。研究發(fā)現(xiàn)雪旺氏細(xì)胞外泌體miR-340可以調(diào)控?fù)p傷的神經(jīng)碎片清除和軸突再生[30]；而miR-221/222在周圍神經(jīng)修復(fù)過程中可以通過靶向LASS2基因調(diào)控雪旺氏細(xì)胞的遷移和增殖，并誘導(dǎo)雪旺氏細(xì)胞表型改變[45]。M2型巨噬細(xì)胞外泌體miR-223通過上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子和層粘連蛋白表達(dá)促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞遷移和增殖，進(jìn)而加速周圍神經(jīng)修復(fù)[46]。MSCs外泌體miR-17-92簇通過調(diào)控PTEN/mT1OR通路促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，并且可以增強(qiáng)神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)[47-48]；多能間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-133b可以提高神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)[49-50]；經(jīng)LPS預(yù)處理的MSCs外泌體let-7b通過TLR4/NF-κB/STAT3/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并激活M1型巨噬細(xì)胞[51],促進(jìn)神經(jīng)損傷部位血管生成,從而加速“神經(jīng)橋”的建立。

圖2 外泌體miRNA在PNI修復(fù)中的作用

4 展望

盡管顯微外科及神經(jīng)移植等修復(fù)PNI的方法可以恢復(fù)周圍神經(jīng)的連續(xù)性，但神經(jīng)功能的恢復(fù)效果仍然不盡如意，PNI的治療依舊是臨床的棘手問題。PNI修復(fù)再生是一個(gè)多因素多通路調(diào)控的過程，miRNA及外泌體包含的miRNA在這個(gè)過程中發(fā)揮著復(fù)雜重要的作用，更加深入的探討PNI修復(fù)機(jī)制，據(jù)修復(fù)過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)研發(fā)新型藥物以干預(yù)神經(jīng)修復(fù)過程，例如使華勒變性順利完成、促進(jìn)雪旺細(xì)胞去分化為修復(fù)雪旺細(xì)胞、促修復(fù)雪旺細(xì)胞增殖遷移、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)因子表達(dá)以及加速軸突再生等，是將來治療PNI的新方向，值得繼續(xù)深入研究。