薛 澤 朱麗巖 王博淵 劉正宇

(中國海洋大學海洋生命學院 青島 266003)

海洋橈足類屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼動物亞門(Crustacea)、橈足綱(Copepoda)。橈足類在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著獨特的生態(tài)位(Kovatchet al,1999),對維持海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡和穩(wěn)定起著重要作用。海洋橈足類營養(yǎng)豐富,富含促進海洋魚蝦生長發(fā)育的EPA和DHA等高不飽和脂肪酸,是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的優(yōu)質餌料,哲水蚤目、劍水蚤目和猛水蚤目的水蚤均適合作為海洋魚蝦的活體餌料(魏玉昌,1987；Drilletet al,2011)。

但目前對于海洋橈足類生物的培養(yǎng)存在瓶頸,難以實現(xiàn)多世代、連續(xù)化培養(yǎng)的技術要求,因此不能達到作為餌料生物的規(guī)?；a(chǎn)的目標,而海洋橈足類培養(yǎng)的關鍵在于建立適宜條件。不同種的海洋橈足類生物、甚至同一種在不同發(fā)育階段對環(huán)境條件及餌料的需求都存在差異。

溫度與鹽度是海洋中重要的生態(tài)因子,不僅能夠決定浮游生物群落的多樣性水平、組成以及分布,而且對于浮游動物的生理與生殖過程影響都比較大。有研究報道,相同適溫條件下不同海洋橈足類、甚至不同適溫條件下的同種橈足類生物的熱耐受能力均存在差異(廖一波等,2008)。溫度的變化也會顯著影響水域中橈足類優(yōu)勢種,卜亞謙等(2019)研究發(fā)現(xiàn),夏冬兩季在渤海、北黃海均出現(xiàn)的優(yōu)勢種為：中華哲水蚤、小擬哲水蚤、擬長腹劍水蚤、強壯箭蟲、橈足類無節(jié)幼蟲和橈足幼體。李光福(2015)發(fā)現(xiàn)溫度與鹽度變化對橈足類的生殖過程影響明顯,能顯著影響指狀偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus inopinus)的孵化率和孵化時間。于娟等(2012)的研究結果表明,溫度變化會顯著影響中華哲水蚤(Calanus sinisus)和猛水蚤(Harcapticussp.)的攝食及排糞,說明其代謝過程也隨溫度變化而變化。蔡澤富等(2011)的現(xiàn)場圍隔研究表明即使0.52°C的溫升也會顯著提高浮游生態(tài)系統(tǒng)代謝速率。另外,溫度還可通過影響水體運動而間接影響浮游動物的移動(Eisneret al,2014)。另一方面,作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要環(huán)境因子,鹽度與動物的生長發(fā)育和繁殖有密切的關系。鹽度小于15或大于35時有明顯抑制Pseudodiaptomus pelagicus幼體和成體的存活率,且對于成體的抱卵間隔和卵囊大小也有顯著影響(Ohset al,2010)。鹽度對于海洋橈足類的攝食作用也具有顯著影響,不同種類對于鹽度變化具有不同的生態(tài)幅與最適鹽度范圍(于娟等,2012)。Michalec等(2012)報道了鹽度變化與Pseudodiaptomus annandalei運動抑制之間的關系,發(fā)現(xiàn)一定范圍內的鹽度升高能有效抑制其雌體與雄體的運動性。鹽度變化還能影響橈足類體內大分子物質的合成,從而影響其代謝與能量分配(Lindleyet al,2011)。

哲水蚤目(Calanoida)的火腿許水蚤(Schmackeria poplesia)與劍水蚤目(Cyclopoida)的擬長腹劍水蚤(Oithona similis)是我國近海兩種重要的橈足類動物。二者的生態(tài)幅存在較大差異：前者常分布在沿海半咸水中,為河口低鹽種,室內研究表明其對鹽度的適應范圍為0—20(黃加祺等,1998),能夠在長江口鹽度低于10的區(qū)域為優(yōu)勢種(紀煥紅等,2006)。在2001—2003年對長江口鄰近水域的調查發(fā)現(xiàn),火腿許水蚤常出現(xiàn)在沿岸半咸水體中(徐兆禮等,2005),并能在5—8月成為優(yōu)勢種,但分布范圍狹小。擬長腹劍水蚤是廣溫廣鹽種,對溫度和鹽度的適應范圍較廣,在我國的黃海渤海都有較多的分布,是膠州灣小型浮游動物中的優(yōu)勢種(朱麗巖等,2009)。事實上,擬長腹劍水蚤在較廣的緯度范圍和季節(jié)跨度都有分布,且食性較廣,對環(huán)境脅迫具有較強的耐受性(Castellaniet al,2005)。故本實驗以火腿許水蚤與擬長腹劍水蚤(Oithona similis)為目標生物,在實驗生態(tài)條件下研究溫度與鹽度的變化對其攝食與代謝的影響,比較二者最適培養(yǎng)條件的差異,并對可能的原因進行探討。研究將為闡明不同橈足類生物對環(huán)境變化的適應機制提供基礎的研究資料,為其室內連續(xù)培養(yǎng)技術提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 目標生物的馴化培養(yǎng)

兩種海洋橈足類生物：火腿許水蚤(S.poplesia)與擬長腹劍水蚤(O.similis)均采自山東青島潮海蝦池,用淺水Ⅱ型浮游生物網(wǎng)采集后在2h內返回實驗室。用篩絹濾去較大雜質,在解剖鏡下挑取活潑、健康、趨光性強的個體,于2L燒杯中馴化3—5d,光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),馴化溫度 5—10°C,鹽度 30,光強 14μmol/(m2·s),光照比L∶D=12h∶12h。每天定時投喂餌料,火腿許水蚤所用餌料混合比例為：金藻∶小球藻∶三角褐脂藻=3∶1∶1,擬長腹劍水蚤所用餌料混合比例為：金藻∶海鏈藻∶青島大扁藻=3∶1∶1,初始混合餌料生物量控制在約104cells/mL。培養(yǎng)及實驗過程中所需的海水及餌料單胞藻的培養(yǎng)條件根據(jù)方寬等(2013)制定。馴化后,用滴管挑取活潑且完整的掛卵雌體移至1L燒杯中,培養(yǎng)溫度逐漸升至15°C。每隔一天收集無節(jié)幼蟲,用100目篩絹過濾后獲得子代個體進行培養(yǎng),每天投喂密度為1×104cells/mL的金藻,其他培養(yǎng)條件同馴化條件。待無節(jié)幼蟲發(fā)育至成體后進行后續(xù)環(huán)境因子的影響實驗。

1.2 實驗體系的構建

研究溫度與鹽度變化對兩種海洋橈足類動物攝食與代謝的影響。實驗中只改變體系中的溫度或鹽度條件,其他培養(yǎng)條件同馴化條件。

(1)溫度實驗：在預實驗的基礎上分別設定溫度梯度,火腿許水蚤為(10±0.5)、(15±0.5)、(20±0.5)和(25±0.5)°C；擬長腹劍水蚤為：(5±0.5)、(10±0.5)、(15±0.5)、(20±0.5)、(25±0.5)和(30±0.5)°C。

(2)鹽度實驗：分別設置5個鹽度梯度：15、20、25、30、35。用鹽度為30的過濾海水配置各個鹽度梯度的海水,鹽度低于30的海水通過添加蒸餾水配制,鹽度為35的海水通過加入固體海水鹽配制,所有經(jīng)過配制海水均經(jīng)過0.22μm膜過濾。

1.2.1 對攝食率與濾水率的影響 用攝食率與濾水率的變化表征兩種橈足類動物攝食作用的變化。挑選未掛卵的成體在盛有過濾海水的燒杯中馴化5天,每48h用虹吸法去除燒杯表面和底部的雜質,將液體表面和底部的過剩食物、死亡個體和糞團等清除干凈,其他馴化條件同1.1所述。馴化5d后進行攝食率與濾水率實驗。用膠頭滴管吸取50—70只健康活潑的兩種橈足類個體置于含有80mL過濾海水的100mL燒杯中,饑餓24h后進行攝食實驗。

用膠頭滴管分別取10只經(jīng)過饑餓處理的目標生物放入盛有80mL過濾海水的燒杯中,然后分別暴露于不同的溫度與鹽度條件下。向所有處理組添加金藻原液,使得藻細胞密度控制在104cells/mL,每處理組設2個平行。實驗以不投加水蚤的一組為對照組。用黑色塑料袋包裹處理組和對照組的燒杯,將其置于黑暗的培養(yǎng)箱中,每隔2h晃動一次,盡量避免藻細胞沉降。24h后,取各燒杯溶液于1.5mL PE管中,魯哥氏碘液固定,血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù),餌料濃度差減法計算攝食率(G,grazing rate)和濾水率(F,filtering rate)(Frost,1972)。

式中,V為試驗溶液的體積；N為每個實驗燒杯中輪蟲個體數(shù)(ind.)；c0為起始餌料密度(×104cells/mL)；ct為對照組中最終餌料密度(×104cells/mL)；ctf為實驗組中最終餌料密度(×104cells/mL)；t為實驗組中最終餌料密度(×104cells/mL)。

1.2.2 對耗氧率、排氨率和氧氮比的影響 用耗氧率與排氨率的變化表征兩種橈足類動物代謝作用的變化。將裝有重過濾海水的碘量置于不同的溫度、鹽度實驗條件下。挑取各個溫度下馴化的健康活潑,不掛卵的火腿許水蚤成體10只,加入碘量瓶后用重過濾海水補充滿,密封瓶口后,置于黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中進行耗氧實驗。24h后用100目篩絹濾除水蚤后用以耗氧率與排氨率的研究：一部分根據(jù)碘量瓶中溶解氧含量的變化分析耗氧率的變化,另一部分用靛酚藍分光光度法測定水樣中的氨濃度變化以確定排氨率的變化(徐兆禮等,2005)。氧氮比(O/N)即為耗氧率與排氨率之比。

1.3 統(tǒng)計分析

Sigmaplot10.0作圖,各指標以平均值±標準差(mean±SD)表示；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用IBM SPSS Statistics 19中的one-way ANOVA及獨立樣本T檢驗進行,其中顯著性水平設置為0.05,P＜0.05即認為差異顯著,P＜0.01認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境因子變化對兩種橈足類生物攝食的影響

2.1.1 溫度對攝食的影響 在10—25°C的溫度范圍內,隨著溫度的升高,火腿許水蚤的攝食率與濾水率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在15°C時達到最大值,顯著高于其他各溫度處理組(P＜0.05)；之后逐漸下降,在25°C降至最低(圖1a)。擬長腹劍水蚤在不同溫度條件下攝食作用的變化不同與火腿許水蚤：在5—25°C的溫度范圍內攝食率與濾水率保持持續(xù)上升,并在25°C達到峰值；溫度升至30°C時略有下降(P＞0.05),但仍保持較高的水平(圖1b)。

圖1 溫度對火腿許水蚤(a)及擬長腹劍水蚤(b)攝食率和濾水率的影響Fig.1 Effect of temperature on grazing rate and filtering rate of S.poplesia(a)and O.similis(b)

2.1.2 鹽度對攝食的影響 在實驗鹽度范圍內,火腿許水蚤攝食率和濾水率隨鹽度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,但各鹽度之間無顯著差異(P＞0.05)；鹽度25時攝食最為旺盛,鹽度上升至30時濾水率和攝食率反而有所下降(圖2a)。擬長腹劍水蚤攝食作用對鹽度的耐受性強于火腿許水蚤。在實驗的鹽度范圍內(15—35)其攝食率和濾水率表現(xiàn)為先抑后揚的變化趨勢：在15—25的范圍內隨著鹽度的升高而升高,并于鹽度25時達到峰值,之后逐漸下降。研究結果表明,擬長腹劍水蚤的攝食能力在25—30的鹽度區(qū)間保持穩(wěn)定,超過這一范圍,攝食能力開始大幅降低。

圖2 鹽度對火腿許水蚤(a)及擬長腹劍水蚤(b)攝食率和濾水率的影響Fig.2 Effect of salinity on grazing rate and filtering rate of S.poplesia(a)and O.similis(b)

2.2 環(huán)境因子變化對兩種橈足類生物代謝的影響

2.2.1 溫度對代謝的影響 如圖3所示,在實驗溫度范圍內(5—20°C),火腿許水蚤的耗氧率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢,15°C時達到最高點后逐漸下降；排氨率的變化與耗氧率類似,在5—20°C范圍內逐漸上升至峰值,然后逐漸下降,至30°C時降至最低,呈現(xiàn)“倒鐘形”變化。擬長腹劍水蚤耗氧率與排氨率的變化趨勢均與火腿許水蚤不同。前者耗氧率在5—25°C范圍內隨著溫度升高而不斷增大,在25°C達到最大值,之后稍有下降(P＞0.05)；其中有兩個溫度范圍：10—15°C與20—25°C的耗氧率增加顯著(P＜0.05)。其排氨率隨溫度升高而緩慢增加,在20°C時達到峰值,之后隨著溫度繼續(xù)升高逐漸下降,至30°C時降至最低。

火腿許水蚤氧氮比隨溫度升高而先升高再降低,于15°C時達到峰值。而擬長腹劍水蚤的氧氮比隨溫度升高而不斷升高,較之于前者在低于25°C的溫度區(qū)間變化平緩,只在30°C時有極顯著的增高(P＜0.01)。

圖3溫度對火腿許水蚤(a)及擬長腹劍水蚤(b)代謝的影響Fig.3 Effect of temperature on oxygen consumption,ammonia excretion rate,and O/N ratio of S.poplesia(a)and O.similis(b)

2.2.2 鹽度對代謝的影響 如圖4所示,鹽度范圍為15—25時,火腿許水蚤的耗氧率隨著鹽度的增加不斷上升,至鹽度25時達到最高；但繼續(xù)升高至35時,耗氧率顯著降低(P＜0.05)。擬長腹劍水蚤的耗氧率隨著鹽度升高不斷降低,鹽度為30時降至最低點。在實驗的鹽度范圍內,兩種海洋橈足類的氧氮比都有著先升高后降低的趨勢。擬長腹劍水蚤O/N在9—18之間變化,峰值17.7出現(xiàn)在鹽度為35時；火腿許水蚤O/N的變化范圍為32—95,在鹽度為20時達到最大值。

排氨率數(shù)據(jù)顯示,在鹽度范圍為15—30時擬長腹劍水蚤的排氨率隨著鹽度的增高不斷下降,鹽度升至35時反而有所增加,且顯著高于鹽度30時的排氨率(P＜0.05)；火腿許水蚤隨著鹽度的升高而先升高后降低,且相較差異不顯著(P＞0.05)。結果說明,擬長腹劍水蚤在鹽度為30時氨氮代謝水平最低,而火腿許水蚤在鹽度為15和35時氨氮代謝較低。

圖4 鹽度對火腿許水蚤(a)及擬長腹劍水蚤(b)代謝的影響Fig.4 Effect of salinity on oxygen consumption,ammonia excretion rate and O/N ratio of S.poplesia(a)and O.similis(b)

3 討論

3.1 對溫度的響應差異與途徑

本研究結果表明,溫度變化對擬長腹劍水蚤攝食作用的影響較小,但對火腿許水蚤的影響較大,尤其低溫條件的影響更顯著。溫度對二者的代謝作用也表現(xiàn)出明顯的種間差異：隨著溫度的增加,擬長腹劍水蚤穩(wěn)定在較高的耗氧率水平,火腿許水蚤持續(xù)較低的耗氧水平。我們嘗試對這種變化趨勢做進一步分析。

箱線圖(Box-and-Whisker)是一種重要的探索性數(shù)據(jù)分析工具,不僅能夠反映原始數(shù)據(jù)位置與分散情況,而且能直觀反映某一因子在變化當中的作用,其中下四分位線(Q1)與上四分位線(Q3)之間的四分位距及其與中位數(shù)之間的距離能清晰表明因子對結果分布的影響。本研究基于箱式圖的分析顯示(圖5),溫度變化對火腿許水蚤的耗氧率與排氨率的四分位距(Q1—Q3)較擬長腹劍水蚤大,同時中位線更明顯地偏向于Q1,大約有75%的數(shù)據(jù)分布偏向于高耗氧率,說明隨著溫度的增加火腿許水蚤穩(wěn)定在較高的耗氧率水平,且較高的呼吸率與排氨率也反映出較高的代謝潛力。擬長腹劍水蚤的耗氧率數(shù)據(jù)分布均勻,四分位距明顯小于火腿許水蚤,且中位數(shù)基本位于Q1—Q3中部,說明在整個溫度變化過程中擬長腹劍水蚤的代謝水平變化不大。用二者的耗氧率與排氨率比例分析其在不同溫度條件下的響應差異,發(fā)現(xiàn)在10°C時,火腿許水蚤與擬長腹劍水蚤的耗氧率與排氨率之比約分別為100∶7與91∶100；在20°C時,兩者排氨率均達到峰值,同時耗氧率與排氨率之比降至100∶91與100∶81,說明隨著溫度的持續(xù)升高,二者的呼吸率差異逐漸減小,且二者的氨氮代謝差異主要在15—20°C的溫度區(qū)間。結果表明,兩種橈足類生物可通過不同代謝途徑響應環(huán)境溫度的變化。

圖5 溫度對火腿許水蚤及擬長腹劍水蚤代謝影響的箱線圖分析Fig.5 Effect of temperature on oxygen consumption and ammonia excretion rate of S.poplesia and O.similis analyzed in Box-and-Whisker chart

O/N比能夠反映生物機體對能源物質代謝和利用的宏觀指標,通常來說,當O/N在24左右時生物對脂肪和蛋白質的利用處于一個平衡的狀態(tài)；O/N＞24時生物偏好利用脂肪類物質,O/N＜24時說明生物利用蛋白類物質的能力增強(Mayzaudet al,1988)。本研究中,火腿許水蚤O/N在整個溫度范圍內的變化不大,比值在13—40之間波動,低于24的居多,說明其主要依靠消耗蛋白質和碳水化合物供能以響應溫度的變化,而擬長腹劍水蚤的O/N僅在30°C時高于24,說明其對高溫的響應主要通過消耗碳水化合物完成。

研究結果說明隨溫度升高火腿許水蚤耗氧率雖然降低但也保持較高水平,反映其有較高的代謝潛力,而擬長腹劍水蚤耗氧水平隨溫度升高而穩(wěn)步提升,與火腿許水蚤差異逐漸減弱。相較于排氨率,擬長腹劍水蚤能在較大的溫度范圍內保持穩(wěn)定的氨氮代謝水平,說明擬長腹劍水蚤對溫度的耐受性更強。

3.2 對鹽度的響應差異及途徑

與對照組相比,較高的鹽度水平(30—35)能顯著降低火腿許水蚤和擬長腹劍水蚤的攝食率及濾水率(P＜0.05),說明其攝食能力收到明顯抑制,且兩者的最適鹽度分別為25及30。基于箱式圖的分析結果顯示(圖6),在整個鹽度范圍中火腿許水蚤保持較高耗氧水平,其耗氧率四分位距(Q1—Q3)較擬長腹劍水蚤大,但鹽度35會顯著抑制其耗氧率。擬長腹劍水蚤50%的耗氧率數(shù)據(jù)分布集中在較小的區(qū)間內,說明在15—25的鹽度區(qū)間擬長腹劍水蚤能保持穩(wěn)定且較高的耗氧水平,而擬長腹劍水蚤的中位線偏向最高值也符合這一觀點。排氨率的變化表明,兩者中位線水平相似,而火腿許水蚤的Q3均顯著高于擬長腹劍水蚤,這說明在15—35的鹽度區(qū)間,擬長腹劍水蚤氨氮代謝較穩(wěn)定；且擬長腹劍水蚤排氨率數(shù)據(jù)的中位數(shù)偏向于最小值,說明隨著鹽度梯度變化,擬長腹劍水蚤的氨氮代謝始終處于較低的水平；在鹽度為20時,兩種水蚤的排氨率差別最小?；鹜仍S水蚤及擬長腹劍水蚤更偏好低鹽度(20—25),二者通過強化自身代謝以抵消低鹽度引起的滲透壓變化對自身的影響。通過分析不同鹽度條件下二者的耗氧率與排氨率之比發(fā)現(xiàn),在鹽度分別為30和35時,擬長腹劍水蚤與火腿許水蚤的耗氧率及排氨率之比分別為100∶12與100∶96和100∶65、67∶100,說明擬長腹劍水蚤對高鹽度的耐受性更好。

生物體對高鹽度、低鹽度的適應機制是不同的,在高滲環(huán)境中生物體通過增加內環(huán)境的滲透壓來應對,而在低滲環(huán)境中生物需要使用主動運輸?shù)姆绞睫D運離子,或是啟動離子轉運蛋白來增加離子攝入,以上兩種機制都需要消耗能量(周顯青等,2001)。劉青等(2012)認為鹽度變化對浮游動物呼吸速率的影響分為三種情況：隨鹽度上升而降低、呈反比；隨鹽度上升而增加,呈正比；隨鹽度上升,耗氧率先增大后降低。如真刺唇角水蚤和太平洋紡錘水蚤(陳麗華等,2001),屬于第一種情況。湯氏紡錘水蚤屬于第二種(Lance,1965)。大多數(shù)河口橈足類屬于廣鹽種,屬于第三種情況。本研究結果表明,鹽度對于兩種橈足類生物代謝的影響不同,對擬長腹劍水蚤的影響屬于第一種情況,對于火腿許水蚤的影響屬于第二種情況,故知擬長腹劍水蚤對鹽度的耐受性較火腿許水蚤更高。

在整個實驗過程中火腿許水蚤的氧氮比始終高于24,這說明其主要依靠分解碳水化合物以響應鹽度的變化；擬長腹劍水蚤的變化正好相反,說明它可能主要依靠消耗蛋白質和碳水化合物供能以抵御鹽度變化。

圖6 鹽度對火腿許水蚤及擬長腹劍水蚤代謝影響的箱線圖分析Fig.6 Effect of salinity on oxygen consumption and ammonia excretion rate of S.poplesia and O.similis analyzed in Box-and-Whisker chart

4 結論

(1)兩種橈足類生物可通過不同代謝途徑響應環(huán)境溫度的變化,且擬長腹劍水蚤對溫度具有較高的耐受性。

(2)火腿許水蚤及擬長腹劍水蚤對低鹽度(20—25)表現(xiàn)出一定的偏好,二者均可通過強化自身代謝以抵消低鹽度引起的滲透壓變化對自身的影響,同時擬長腹劍水蚤對高鹽度(35)的耐受性更強。

(3)基于氧氮比(O/N)變化的代謝作用分析顯示,擬長腹劍水蚤能在較大的溫、鹽度范圍內保持穩(wěn)定的生物代謝水平,具有更高的環(huán)境耐受性。