許 峰 魯建飛 魏永偉 苗 亮 陳 炯,2①

(1.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波大學(xué) 寧波 315211；2.應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315832)

大口黑鱸(largemouth bass,Micropterus salmoides),又名加州鱸,屬于廣溫、肉食性淡水魚類。其原產(chǎn)于北美洲密西西比河流域,自1983年引入我國廣東地區(qū)后,因其適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖周期短、且肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn),被廣泛養(yǎng)殖(王廣軍等,2008)。目前,大口黑鱸已經(jīng)成為我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一,其年產(chǎn)量已超過37.4萬噸(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局,2017)。隨著養(yǎng)殖密度的不斷增加、水體環(huán)境惡化、以及病原微生物的傳播,大口黑鱸病害相關(guān)的報(bào)道也日趨增長(zhǎng)(Fogelsonet al,2016；Jianget al,2019)。導(dǎo)致大口黑鱸病害的病原主要包括細(xì)菌(如柱狀黃桿菌Flavobacterium columnare,諾卡氏菌Nocardia)、病毒(如虹彩病毒Iridoviridae,彈狀病毒Rhabdoviridae)、寄生蟲(如車輪蟲Trichodina,杯體蟲Apiosoma)等(夏焱春等,2018)。

由病毒感染引起的大口黑鱸疾病死亡率高,且難以防治,對(duì)世界范圍內(nèi)的大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的威脅。大口黑鱸病毒首次發(fā)現(xiàn)于1991年的美國弗羅里達(dá)州(Grizzleet al,2002),我國最早發(fā)現(xiàn)于2008年廣東省的佛山地區(qū),被其感染的大口黑鱸死亡率高達(dá)60%以上(鄧國成等,2009)。大口黑鱸病毒性疾病主要有虹彩病毒導(dǎo)致的潰瘍病、脾腎壞死病,彈狀病毒導(dǎo)致的旋轉(zhuǎn)病等(鄧國成等,2011)。大口黑鱸在被虹彩病毒感染后,體表會(huì)有斑塊狀出血性潰瘍,尾柄紅腫潰瘍,病魚肝臟腫大、顏色發(fā)白或發(fā)黃,也有的發(fā)病魚體表雖完好但脾臟腫大(黃耀鋒,2017)。

本研究從浙江寧波某養(yǎng)殖場(chǎng)采集了患病的大口黑鱸樣本,通過其體表病患特征及內(nèi)臟剖檢推測(cè)為病毒引起的潰瘍綜合征。綜合采用鯉魚上皮瘤細(xì)胞(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)培養(yǎng)、透射電子顯微鏡超薄切片觀察、分子生物學(xué)分析等方法,分離得到一株病毒,鑒定其為虹彩病毒科蛙病毒屬病毒,命名為大口黑鱸虹彩病毒寧波分離株(LMBIVNB001)。本報(bào)道為后續(xù)針對(duì)該病毒的防控及免疫相關(guān)研究工作提供了基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年7月于浙江寧波某養(yǎng)殖場(chǎng)采集了10尾體表出血或潰瘍癥狀的大口黑鱸,病魚體長(zhǎng)約15—20cm,魚體于水面下暗游,反應(yīng)遲鈍,發(fā)病時(shí)魚塘水溫24°C,水質(zhì)正常。采集的樣本分別使用封口袋單獨(dú)保存,并通過冰盒低溫運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,于-80°C超低溫冰箱內(nèi)凍存以備實(shí)驗(yàn)室分析。

1.2 細(xì)胞系、試劑與主要儀器

EPC系由本實(shí)驗(yàn)室保存,其培養(yǎng)基為M199(Hyclone),含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Gibico),培養(yǎng)溫度 25°C；LATaqDNA 聚合酶、pMD19T simple、dNTPs、DL2000 DNA Marker均購自大連TaKaRa公司；DNA提取、膠回收、質(zhì)粒抽提試劑盒均購自美國Omega公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、細(xì)菌培養(yǎng)基等常用試劑均購自生工生物工程(上海)股份有限；大腸桿菌(Escherichia coli)TG1由本實(shí)驗(yàn)室保存；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司；普通光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；透射電子顯微鏡購自日本 Hitachi公司；PCR核酸擴(kuò)增儀購自Eppendorf公司；引物合成及序列測(cè)定均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 病原分離

將患病大口黑鱸解剖后,在無菌狀態(tài)下取肝臟、脾臟、腎臟、肌肉等樣品,分別加入10倍體積(V/W)的無菌PBS,冰浴條件下研磨勻漿,將勻漿液分為兩份,其中一份分別在BHI平板、血平板和RS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線,28°C培養(yǎng)24h分離細(xì)菌；另一份轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,置于-70°C室溫條件下反復(fù)凍融3次后,5000g、4°C低溫離心30min,取上清液,經(jīng)0.22μm 濾器(Millipore)過濾,-70°C 凍存?zhèn)溆谩?/p>

EPC細(xì)胞在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)中傳代培養(yǎng),細(xì)胞匯合度為80%—90%時(shí),棄去培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組取200μL病魚組織勻漿過濾液與800μL M199培養(yǎng)基混勻,對(duì)照組為200μL無菌PBS與800μL M199培養(yǎng)基混勻,分別接種于健康EPC細(xì)胞,25°C吸附1h,期間每隔15min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以便均勻吸附。1h后,均補(bǔ)加4mL含2%FBS的M199培養(yǎng)基,置于25°C含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每日于顯微鏡(Nikon)下觀察細(xì)胞狀態(tài)至發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞單層80%出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收獲培養(yǎng)物。收集的病毒液按上述步驟繼續(xù)感染新的健康EPC細(xì)胞,重復(fù)至收獲第6代病毒液。

1.4 電鏡樣品制備

將上述經(jīng)第6代病毒懸液感染后病變的EPC細(xì)胞培養(yǎng)物收集,800g離心25min去除細(xì)胞培養(yǎng)液,收集細(xì)胞沉淀。固定：將細(xì)胞沉淀用2.5%戊二醛固定；用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15min；1%鋨酸固定液固定2h；再用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15min。脫水：50%乙醇15min；70%乙醇15min；90%乙醇 15min；90%乙醇+90%丙酮(1：1)15min；90%丙酮15min；100%丙酮20min。包埋：100%丙酮+包埋液(2：1)室溫 2h；100%丙酮+包埋液(1：2)室溫 2h；包埋液室溫過夜。固化：37°C烘箱12h；60°C烘箱48h。切片：超薄切片機(jī)切片。染色：3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。最后將樣品置于透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 分子克隆鑒定

病魚肝臟、脾臟、腎臟、肌肉組織DNA的提取按照Omega的DNA提取試劑盒說明進(jìn)行操作。參考GenBank中已發(fā)表的虹彩病毒MCP基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,序列如下：LMBV-F：5′-TTTCGGGCAGC AGTTTTCGGT-3′；LMBV-R：5′-CCGTAGTTGGTGG A GCC-3′。以提取的病魚組織DNA為模板,PCR擴(kuò)增MCP部分保守序列,擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μL,其中包括：DNA模板1μL,上下游引物各(10μmol/L)1.0μL,10 × LA buffer 2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)3.5μL,LATaqDNA 聚合酶 0.5μL,ddH2O 15.5μL。反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 5min；94°C 變性 30s,56°C 退火 30s,72°C延伸90s,變性至延伸共32個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收試劑盒回收純化后,與pMD19-T simple載體16°C連接3h,連接的反應(yīng)體系為：切膠回收的DNA片段 4μL,pMD19-T Simple 1μL,Solution Ⅰ 5μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞后,涂布于含100mg/mL氨芐青霉素(Amp)的Luria Broth(LB)平板上,37°C培養(yǎng)過夜,挑取5個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),抽提質(zhì)粒,PCR鑒定,選取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析

將測(cè)序得到的病毒MCP部分核苷酸序列用BioEdit軟件和 BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)分析,然后選取GenBank中與測(cè)得序列相似的參考毒株,采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)。構(gòu)建進(jìn)化樹使用的參考毒株及其序列登錄號(hào)分別為：鱖魚蛙病毒(MG941005)、桑蒂庫珀蛙病毒(NC_038508)、大口黑鱸潰瘍綜合征病毒(GU2 56635)、孔雀魚病毒(FR677325)、小口黑鱸病毒(KY82 5779)、錦鯉蛙病毒(KJ939444)、流行性造血器官壞死病病毒(AY187045)、虎紋蛙病毒(AY033630)、中華鱉病毒(DQ335253)、蛙病毒3型(FJ459783)、傳染性脾腎壞死病毒(AF370008)、條石鯛虹彩病毒(HQ105005)和淋巴囊腫病病毒I型(EF103188)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚主要癥狀

患病大口黑鱸主要癥狀為體表出血。在其體表可見多處潰爛及出血點(diǎn),鰭條基部、尾柄處紅腫出血(圖1a)；解剖發(fā)現(xiàn)其脾臟腫大,顏色暗紅發(fā)黑,肝臟發(fā)白并有出血點(diǎn)(圖1b)。病魚具有因病毒感染引發(fā)的潰瘍綜合征的典型癥狀。

2.2 分離病毒引起EPC細(xì)胞病變

從病魚肝臟、脾臟、腎臟、肌肉中均未分離得到細(xì)菌。

由于病魚具有被虹彩病毒感染后的典型癥狀,而該病毒能引起EPC細(xì)胞病變(Halalyet al,2019),所以采用EPC細(xì)胞進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。病魚組織勻漿過濾液感染EPC細(xì)胞36h后,可見緊密生長(zhǎng)的EPC細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落的病變現(xiàn)象(cytopathic effect,CPE),繼續(xù)培養(yǎng)12h后可見因細(xì)胞死亡脫落形成的空洞(圖2)。被感染的EPC細(xì)胞在72h內(nèi)全部收縮呈球狀,脫離瓶壁。

圖1 患病大口黑鱸體表及內(nèi)臟病癥Fig.1 The external and visceral symptoms of diseased largemouth bass

圖2 患病大口黑鱸分離病毒液感染EPC細(xì)胞形成的病變Fig.2 Cytopathic effect of virus liquid on EPC cells under a microscope

2.3 電鏡觀察

通過電子顯微鏡技術(shù)可以直觀地觀察到病毒粒子形態(tài)特征。病魚組織勻漿液感染EPC細(xì)胞后,經(jīng)電鏡超薄切片觀察,可見細(xì)胞內(nèi)存在大量直徑約120nm、具有囊膜的正六邊形病毒顆粒(圖3)。

2.4 MCP基因鑒定及序列分析

圖3 病毒懸液感染EPC細(xì)胞的超薄切片透射電鏡觀察Fig.3 Ultra-thin section observation of virus liquid-infected EPC cells under TEM

提取的病魚肝臟、脾臟、腎臟和肌肉組織DNA分別采用引物L(fēng)MBV-F和LMBV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,均獲得長(zhǎng)度約1kb的目的條帶(圖4a),將其切膠回收、連接至pMD19-T simple克隆載體,轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞,涂平板培養(yǎng)后選取6個(gè)菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果如圖4b所示,所選菌落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1kb處有明顯條帶,與預(yù)期結(jié)果相同。選取其中的2個(gè)陽性克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序,獲得長(zhǎng)度為1029bp的序列,經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對(duì),Bioedit軟件分析,結(jié)果顯示,擴(kuò)增得到的序列與鱖魚蛙病毒NH-1609、大口黑鱸潰瘍綜合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP核苷酸同源性最高,相似度均為99.13%(表1)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,本研究分離得到的病毒與鱖魚蛙病毒、大口黑鱸潰瘍綜合征病毒聚成一簇,屬于虹彩病毒科的蛙病毒屬(圖5),將其命名為大口黑鱸虹彩病毒寧波分離株(Largemouth bass iridovirus,LM BIV-NB001),上傳至GenBank后獲得的登錄號(hào)為MN176304。

3 討論

圖4 患病大口黑鱸分離病毒MCP片段的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identification of the partial MCP of virus from diseased fish and the cloned plasmid

表1 LMBIV-NB001株MCP基因部分序列與其他虹彩病毒的同源性比較Tab.1 Comparison between LMBIV-NB001 strain and other iridovirus on the MCP gene partial sequence identity

圖5 采用鄰接法基于MCP基因部分序列同源性的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of LMBIV-NB001strain with other iridovirus based on MCP gene partial sequence homologues using the neighbor-joining method

虹彩病毒科(Iri dov irid ae)包括蛙病毒屬(Ranavirus)、腫大細(xì)胞虹彩病毒屬(Megalocytivirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、虹彩病毒屬(Iridovirus)和綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus),是一個(gè)大型二十面體病毒家族,其雙鏈DNA基因組的大小從103kb到220kb不等(Chincharet al,2017a,b)。不同屬的病毒在感染同種或不同物種后的影響可能從沒有明顯的損傷或行為變化到嚴(yán)重的損傷甚至死亡(Lesbarrèreset al,2012)。近年來,由虹彩病毒科蛙病毒屬引發(fā)的疾病在世界范圍內(nèi)廣泛流行(Breneset al,2014),其在兩棲動(dòng)物、魚類以及爬行動(dòng)物中均有報(bào)道(Priceet al,2017；McKenzieet al,2019；Saucedoet al,2019)。大口黑鱸蛙病毒病高發(fā)于水溫25—30°C的夏季,主要危害成魚,且致死率高,一旦暴發(fā)將會(huì)給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失(鄧國成等,2011)。中國大鯢(Andrias davidianus)在被蛙病毒屬病毒感染后出現(xiàn)體表潰瘍、頭部脹大且有出血點(diǎn)、尾部潰爛等病理特征(張星朗等,2014)；大口黑鱸在被病毒感染后常出現(xiàn)皮膚潰瘍、肝脾腎腫大、肌肉壞死以及鰭基、尾柄充血或出血等癥狀(馬冬梅等,2016),這與本研究中采集的病魚所表現(xiàn)出的病癥非常相似。蛙病毒屬病毒可以感染中國大鯢胸腺細(xì)胞(Chinese giant salamander thymus cells,GSTC)和EPC細(xì)胞,使細(xì)胞發(fā)生病變(Keet al,2019)。為了確定病原,本研究首先進(jìn)行了細(xì)菌分離,在未分離得到病原菌的情況下,通過制備病魚組織勻漿液感染EPC細(xì)胞,觀察到EPC發(fā)生細(xì)胞死亡、脫落等病變現(xiàn)象,其病變特征與關(guān)于蛙病毒屬病毒感染EPC細(xì)胞的報(bào)道相似(Denget al,2011；Muet al,2018)。進(jìn)一步通過電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)直徑約120nm的正六邊形有囊膜病毒粒子,其形態(tài)特征與虹彩病毒為具有囊膜、直徑在120—300nm的二十面體結(jié)構(gòu)特征相似(Williams,1996),推測(cè)其為一株虹彩病毒科病毒。

使用分子生物學(xué)方法是鑒定病毒性病原常用的可靠手段,通過對(duì)病毒的保守基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析能夠明確病原的分類地位(Grizzleet al,2003；劉群等,2018；Leiset al,2018)。MCP是虹彩病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因,其基因序列在不同種病毒間既具有高度的保守性,又有一定的差異性,所以MCP序列的分析常用于虹彩病毒的分類和鑒定(Webbyet al,1998；Ohlemeyeret al,2011)。Sivasankar等(2017)利用MCP基因序列分析,從雀鯛(Pomacentrus similis)中鑒定了一株虹彩病毒科蛙病毒；本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已知虹彩病毒的MCP基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,采用PCR擴(kuò)增、測(cè)序后獲得1029bp的病毒核苷酸序列,經(jīng)BLAST搜索比對(duì),其與鱖魚蛙病毒、大口黑鱸潰瘍綜合征病毒的MCP基因核苷酸同源性最高,相似度均高達(dá)99.13%,表明該分離株屬于虹彩病毒科。通過基于MCP核苷酸部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以明確看出,分離得到的LMBIV-NB001毒株與虹彩病毒科蛙病毒屬參考毒株聚為一類,應(yīng)為蛙病毒屬成員。不同地區(qū)蛙病毒屬成員毒株的分離和鑒定將對(duì)其起源、進(jìn)化、分類及免疫相關(guān)研究等提供重要的基礎(chǔ)材料。

4 結(jié)論

本研究報(bào)道了一株從患病大口黑鱸中分離的病毒,通過EPC細(xì)胞分離培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR擴(kuò)增特異性基因片段,明確了其分類地位屬于虹彩病毒科蛙病毒屬,將該株病毒命名為大口黑鱸虹彩病毒病毒寧波分離株(LMBIV-NB001)。為進(jìn)一步研究該病毒的生物學(xué)特性、免疫原性、感染機(jī)制以及疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。