陳蜜　岳仁葉　李智　王剛林　馬楠

摘 要 MicroRNA（miRNA）的檢測(cè)在癌癥診斷和治療中具有重要意義。本研究設(shè)計(jì)了DNA序列，組裝了3組金納米粒子-量子點(diǎn)復(fù)合物， 基于此疊加構(gòu)建了以熵驅(qū)動(dòng)催化循環(huán)為模型的單重、雙重和多重循環(huán)放大的3種納米傳感器。疊加的傳感器中，上層復(fù)合物催化循環(huán)解組裝輸出的產(chǎn)物作為下層復(fù)合物的催化鏈，引發(fā)其解組裝，釋放更多熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了多重放大。傳感器中每疊加一個(gè)核酸催化循環(huán)體系，檢測(cè)限降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，最終構(gòu)建的傳感器的檢測(cè)限達(dá)到fmol/L級(jí)。本研究通過(guò)串聯(lián)熵驅(qū)動(dòng)的核酸催化循環(huán)體系，構(gòu)建了動(dòng)態(tài)可調(diào)的、可定量檢測(cè)細(xì)胞中不同表達(dá)水平miRNA的新型納米傳感器。

關(guān)鍵詞 miRNA; 金納米粒子; 量子點(diǎn); 核酸循環(huán); 熒光檢測(cè)

1 引 言

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的小尺寸的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸[1～4]。miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體，降解mRNA或阻礙mRNA的翻譯[5]。miRNA不僅在生物調(diào)節(jié)途徑中起重要作用[6]，也參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等病理過(guò)程[7]。miRNA的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是診斷癌癥的重要生物標(biāo)志物[8～12]。然而，miRNA序列的高度同源性、尺寸小以及在生物體內(nèi)含量低等特點(diǎn)[13]，使癌細(xì)胞中miRNA的精準(zhǔn)、靈敏檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性。在過(guò)去的十幾年中，研究者開發(fā)了很多技術(shù)以提高檢測(cè)miRNA的靈敏度[14～17]，如定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)能靈敏地定量檢測(cè)低表達(dá)的miRNA[17，18]，但該方法的儀器設(shè)備昂貴且耗時(shí)長(zhǎng)。

近年來(lái)，作為一種有效的信號(hào)放大策略，核酸循環(huán)為檢測(cè)低濃度目標(biāo)物提供了一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)[19，20]。Yin等[21]采用雙鏈特異性核酸酶剪切與miRNA雜交的分子信標(biāo)放大熒光信號(hào)，但核酸酶并不能普遍適用于復(fù)雜的生物環(huán)境體內(nèi); Wu等[22]利用兩個(gè)發(fā)夾DNA間循環(huán)催化反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)的mRNA，一個(gè)靶目標(biāo)分子經(jīng)過(guò)發(fā)夾DNA循環(huán)反應(yīng)后，輸出多個(gè)熒光信號(hào)，但熒光染料光學(xué)性能的局限性影響了方法靈敏度。

金納米粒子（GNP）具有比表面積大、生物相容性好和毒性低等特性，可作為載體將核酸運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)[23，24]，并且對(duì)熒光基團(tuán)有很好的淬滅能力[25]。與傳統(tǒng)的熒光染料相比， 量子點(diǎn)（Quantum dots， QDs）具有發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)節(jié)、量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像領(lǐng)域[26～29]。 Ma等[30]以DNA為模板一步合成生物功能化的水相碲化鎘量子點(diǎn)（CdTe QDs），簡(jiǎn)化了QDs生物功能化的步驟，為構(gòu)建基于QDs的納米傳感器提供了參考。 Ma等[31]報(bào)導(dǎo)了以熵驅(qū)動(dòng)核酸催化循環(huán)[32]為模型構(gòu)建的GNP和QDs組裝的納米傳感器，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA，檢出限達(dá)到pmol/L級(jí)。盡管對(duì)于提高檢測(cè)miRNA靈敏度的研究取得了一些進(jìn)展[33，34]，但不同癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)水平差異顯著，常規(guī)傳感器的檢測(cè)限和線性檢測(cè)區(qū)間限制了其在定量分析miRNA中的實(shí)際應(yīng)用。

本研究通過(guò)合理設(shè)計(jì)DNA序列，組裝了3組金納米粒子-碲化鎘量子點(diǎn)復(fù)合物（GNP-QDs composite， GQC），并依次疊加構(gòu)建了以熵驅(qū)動(dòng)催化循環(huán)為模型的單重、雙重和多重循環(huán)放大的3種納米傳感器。疊加的傳感器中，上層GQC催化循環(huán)解組裝輸出的產(chǎn)物作為下層GQC的催化鏈，引發(fā)其解組裝，釋放更多熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)QDs熒光信號(hào)的多重放大。通過(guò)疊加多個(gè)催化循環(huán)體系[35]調(diào)控傳感器的線性檢測(cè)區(qū)間，降低檢測(cè)限，用于定量檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)不同表達(dá)水平的miRNA。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

FE20K酸度計(jì)（美國(guó)Mettler Toledo公司）; AvaSpec-ULS2048-USB2 熒光光譜儀（荷蘭Avantes公司）;? Tecnai G2 F20 S-Twin透射電鏡 （美國(guó)FEI公司）;? Agilent 8453 紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó) Agilent 公司）; GelDoc-It 310 UVP 凝膠成像儀（美國(guó) UVP 公司）; Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳裝置（美國(guó) Bio-Rad 公司）; DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀（北京六一儀器廠）; Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)TECAN公司）; Nano ZS90 激光粒度儀（英國(guó) Malvern 公司）; Olympus IX71 倒置熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）。

氯化鎘（CdCl2， 99.99%）、谷胱甘肽（GSH， 98%）、碲粉（Te， 99.99%）、硼氫化鈉（NaBH4， 98%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O， 99.9%）均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司; 瓊脂糖（Agrose，99%）購(gòu)自Biowest公司; 檸檬酸鈉（99%）購(gòu)自百靈威公司; 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、過(guò)硫酸銨（APS）、MgCl2、NaCl、NaOH、乙酸（HAc）、HNO3、無(wú)水甲醇（CH3OH）均至少為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;? HCl購(gòu)自強(qiáng)盛功能公司; 聚丙烯酰胺（40%）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED，98%）、甘油（99.0%）購(gòu)自北京索萊寶公司; 二硫蘇糖醇（DTT， 99%）、6-巰基-1-己醇（MCH， 98.0%）購(gòu)自阿拉丁試劑公司; 三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP，98.0%）購(gòu)自TCI公司; HeLa細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心; 22Rv1細(xì)胞系購(gòu)自上海生物科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心; DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、1×PBS緩沖溶液、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自Hyclone公司; miRcute miRNA分離試劑盒購(gòu)自Tiangen Biotech公司。巰基修飾（Thiolated）DNA購(gòu)自Takara公司; 熒光染料修飾的DNA購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;硫代DNA以及其它未修飾DNA（序列見表1）購(gòu)自IDT公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q Direct8 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 以硫代DNA為模板一步合成CdTe QDs

按文獻(xiàn)＼[30＼]的方法，用Te和NaBH4制備Te離子的前驅(qū)液; 以GSH為配體，與CdCl2配制Cd離子前驅(qū)液，與硫代DNA混合后加入Te離子前驅(qū)液， 混勻后在100℃下反應(yīng)，可一步合成DNA4修飾CdTe QDs（Q1）、DNA5修飾CdTe QDs（Q2）和DNA6修飾CdTe QDs（Q3）。用30 kD離心超濾管離心超濾（12500 r/min， 3 min）兩次，重新分散于水中。根據(jù)文獻(xiàn)＼[36＼]方法計(jì)算濃度。

2.2.2 GNP的合成以及表面DNA的修飾 采用檸檬酸還原法合成約13 nm的GNP[32]，用 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定520 nm處吸光度， 并計(jì)算GNP的濃度（摩爾吸光系數(shù)為2.7×108 L/（cm·mol）。? 在巰基DNA1、 DNA2和DNA3中加入TCEP， 孵育2 h， 將GNP和巰基DNA按1∶80的摩爾比例混合，37℃恒溫?fù)u蕩1 h后離心，加入檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液（pH 3），搖蕩1 h，12500 r/min離心7 min，分散在1×PBS中，得到GNP -DNA1（G1）、GNP-DNA2（G2）和GNP -DNA3（G3）。

2.2.3 GQC的組裝 將G1與L1按摩爾比1∶60混合，加入NaCl（終濃度50 mmol/L）和MgCl2（終濃度2.5 mmol/L），于37℃反應(yīng)過(guò)夜，12000 r/min離心6 min，分散在1×PBS緩沖液中。將組裝好的G1-L1與Q1按照GNP與QDs摩爾比為1∶60混合，加入NaCl（終濃度50 mmol/L）和MgCl2（終濃度2.5 mmol/L） 37℃反應(yīng)3 h，緩慢降至室溫。12000 r/min離心7 min，分散于1×PBS緩沖液中，得到復(fù)合物GNP-QDs1（GQC1）。按同樣步驟，分別通過(guò)L2和L3將G2和Q2、G3和Q3組裝成GQC2和GQC3。

2.2.4 GNP修飾DNA數(shù)量的測(cè)定 將序列與DNA1一致的FAM-DNA1按照2.2.2節(jié)的步驟修飾在GNP表面，取100 μL FAM-DNA1-GNP（36.5 nmol/L）與80 μL DTT（10 mmol/L）混合，振蕩12 h，14000 r/min離心5 min，收集上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。酶標(biāo)儀測(cè)定濃度分別為10、20、30、40和50 nmol/L 的FAM-DNA1熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GNP表面連接的FAM-DNA1的濃度，與GNP濃度的比值即為GNP表面修飾DNA1的數(shù)量。GNP表面修飾的DNA2和DNA3的數(shù)量按照以上方法測(cè)定。

將與L1序列一致的FAM-L1與G1按照2.2.3節(jié)組裝，測(cè)定GNP連接的L1條數(shù)。采用同樣方法測(cè)定和計(jì)算GNP表面連接的L2和L3的數(shù)量。

2.2.5 納米復(fù)合物特異性測(cè)試

用1×PBS緩沖液配制一系列含5 nmol/L GNP 的GQC1溶液，并與 F1（終濃度60 nmol/L）混合，加入miR-21（終濃度為100、10、2、1、0.2、0.1和 0 nmol/L）; 對(duì)照組（C' control）的GQC1中加入終濃度為100 nmol/L miR-141和 60 nmol/L F1， 37℃反應(yīng)6 h，12000 r/min離心3 min，取上清液測(cè)熒光信號(hào)。

2.2.6 納米傳感器的構(gòu)建和循環(huán)檢測(cè)DNA 由GNP濃度為5 nmol/L GQC1構(gòu)建傳感器C1;? 由GNP濃度均為5 nmol/L GQC1和GQC2混合（即串聯(lián)），構(gòu)建傳感器C2; 由GNP濃度分別為5、5和10 nmol/L的 GQC1、GQC2和GQC3混合，構(gòu)建傳感器C3。

在3組傳感器C1、C2和C3中加入對(duì)應(yīng)的fuel DNA（終濃度分別是60 nmol/L F1; 60 nmol/L F1和60 nmol/L F2; 60 nmol/L F1、60 nmol/L F2和120 nmol/L F3），加入靶分子C'至終濃度分別是100、10、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001和0 nmol/L，在37℃分別反應(yīng)6、8和12 h。離心，測(cè)定上清液熒光信號(hào)，下層沉淀用1×PBS緩沖液分散后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.7 固定細(xì)胞成像 在48孔板中接種HeLa細(xì)胞和22Rv1細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)約2×104個(gè)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用甲醇固定，加入傳感器C1、C2和C3以及相應(yīng)的Fuel DNA，培養(yǎng)箱中37℃孵育6、8和12 h，用1×PBS緩沖液清洗細(xì)胞，采用熒光倒置顯微鏡成像。

2.2.8 提取RNA定量檢測(cè)miRNA 在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別接種HeLa細(xì)胞和22Rv1細(xì)胞，待2種細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，采用試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，測(cè)量總RNA在260 nm處的吸光度（1 OD=40 ng/μL RNA）。將提取的RNA稀釋，與相應(yīng)FuelDNA混合后加入對(duì)應(yīng)的傳感器中，測(cè)定熒光光譜，計(jì)算熒光恢復(fù)率，并根據(jù)線性曲線計(jì)算miR-141在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 QDs和GNP組裝和表征

DNA功能化CdTe QDs的吸收光譜和熒光譜如圖1A所示， QDs的最大吸收峰位于571 nm（曲線a），最大發(fā)射波長(zhǎng)為627 nm（曲線b）， 計(jì)算QDs的量子產(chǎn)率為17.6%[32]。采用透射電鏡和高分辨透射電鏡對(duì)QDs進(jìn)行表征（圖1B）， QDs直徑為（3.43±0.18） nm。QDs進(jìn)行凝膠電泳圖譜見圖1C，QDs表面大多修飾了一條DNA鏈。

GNP電鏡表征圖如圖2A所示，其直徑為（15.48±0.23） nm。使用DTT法測(cè)得每個(gè)GNP表面修飾了36條巰基DNA和20條Linker DNA。瓊脂糖電泳表征圖（圖2B）和電鏡表征圖（圖2C）都表明GNP和QDs形成了組裝體，且每個(gè)GNP表面組裝了約12個(gè)QDs[32]。

3.2 串聯(lián)傳感器的構(gòu)建以及可行性驗(yàn)證

本研究以熵驅(qū)動(dòng)核酸催化循環(huán)為模型構(gòu)建納米傳感器，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大。在傳感器C1中，Q1通過(guò)L1與G1組裝成GQC1，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，Q1的熒光被G1猝滅，miR-141作為GQC1的靶分子，進(jìn)攻作用位點(diǎn)Toehold 1，將G1取代，由于G1與Q1距離增大，不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，Q1的熒光信號(hào)恢復(fù)。同時(shí)，作用位點(diǎn)Toehold 2暴露，F(xiàn)1與之結(jié)合，將Q1從組裝中取代出來(lái)，同時(shí)又置換出miR-141，miR-141繼續(xù)進(jìn)攻下一個(gè)作用位點(diǎn)Toehold 1，釋放Q1，如此循環(huán)下去，一個(gè)靶目標(biāo)循環(huán)解組裝GQC1輸出多個(gè)Q1熒光信號(hào)（圖3A）。將GQC1和GQC2按1∶1比例疊加構(gòu)建傳感器C2，miR-141作為靶向物催化解組裝GQC1中置換出的Q1作為GQC2的催化鏈，與F2通過(guò)Toehold 3和Toehold 4兩作用位點(diǎn)，按照上述循環(huán)方式繼續(xù)催化解組裝GQC2，釋放Q2。如此，在傳感器C2中輸入一個(gè)靶目標(biāo)分子，能夠輸出多個(gè)Q1和Q2的熒光信號(hào);? 將GQC1、GQC2和GQC3按1∶1∶2比例疊加構(gòu)建傳感器C3，GQC2中被Q1催化解組裝輸出的Q2又作為GQC3的催化鏈，與F3通過(guò)Toehold 5和Toehold 6兩作用位點(diǎn)催化解組裝GQC3，釋放Q3，如此，在傳感器C3中，輸入一個(gè)靶目標(biāo)能夠輸出多個(gè)Q1、Q2和Q3的熒光信號(hào)（圖3B），檢測(cè)靶目標(biāo)miR-141對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，得到多重放大。

采用凝膠電泳表征單鏈DNA間雜交、鏈取代反應(yīng)，以驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性。如圖4所示，泳道g對(duì)應(yīng)在GQC2的單鏈組裝體加入對(duì)應(yīng)的催化鏈（DNA4）和F2后解組裝的條帶;? 泳道h對(duì)應(yīng)將GQC1和GQC2的單鏈組裝體1∶1串聯(lián)，只加入了GQC1的靶目標(biāo)（0.05×C'）和F1和F2的情況; 泳道h中同樣也出現(xiàn)了GQC2單鏈組裝體解組裝的條帶， 并且條帶的熒光強(qiáng)度比泳道g中的條帶的熒光強(qiáng)度高，表明將核酸循環(huán)串聯(lián)可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的多重放大。

考察了GQC1對(duì)miR-141的特異性響應(yīng)。將miR-21按照與L1（100 nmol/L）摩爾比分別為1、0.1、0.02、0.01、0.002、0.001和0的比例，與F1加入至C1傳感器中，與對(duì)照組（C' control）相比，GQC1的熒光強(qiáng)度基本沒(méi)有變化（圖5），即沒(méi)有QDs被miR-21從GQC1解組裝出來(lái)，表明此復(fù)合物可特異性識(shí)別miR-141。

3.3 串聯(lián)傳感器循環(huán)檢測(cè)miRNA

探究3組傳感器C1、C2和C3對(duì)不同濃度的靶向物C'（miR-141）的響應(yīng)能力，將與L1（100 nmol/L）不同摩爾比（1、01、002、001、0005、0002、0001、00005、00002、00001、000005、000002、000001和0）的C'和對(duì)應(yīng)的Fuel加入至C1、C2和C3傳感器中，采用瓊脂糖電泳和熒光光譜表征復(fù)合物解組裝的程度。

如圖6所示，隨著C'/L1的比例不斷增加， 復(fù)合物解組裝越完全，在泳道中遷移速率越快。傳感器C1、C2和C3分別對(duì)在0001～1、00001～1和000001～1（C'/L1摩爾比）范圍內(nèi)對(duì)靶向物有響應(yīng)。隨著核酸循環(huán)體系的疊加，對(duì)應(yīng)的傳感器的靈敏度也隨之提高，可響應(yīng)的靶向物濃度更低。因此，可通過(guò)改變疊加的循環(huán)體系的數(shù)量調(diào)控靶向物檢測(cè)范圍。

圖7A～7C是由不同比例的C'/L1分別滴定C1、C2和C3傳感器釋放的QDs的熒光譜圖，在不同C'/L比例下傳感器解組裝釋放的QDs熒光強(qiáng)度與瓊脂糖電泳表征的解組裝結(jié)果基本一致。圖7D為3組傳感器中QDs熒光恢復(fù)率（F/F0-1）與不同比例C'/L1的關(guān)系圖， 根據(jù)圖7D將3組傳感器檢測(cè)的C'/L1摩爾比例區(qū)間轉(zhuǎn)化為C'濃度區(qū)間，其中C1為10-10～10-7 mol/L，C2為10-11～10-7?mol/L，C3為10-12～10-7mol/L，可見每疊加一個(gè)核酸催化循環(huán)體系，其對(duì)應(yīng)的傳感器最低檢測(cè)范圍降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。

根據(jù)圖8中3組傳感器的線性檢測(cè)曲線，計(jì)算C1、C2和C3的檢測(cè)限分別為47.3 pmol/L、4.23 pmol/L和552 fmol/L（3σ/k）。

3.4 固定細(xì)胞成像

miR-141在22Rv1細(xì)胞中表達(dá)含量高， 在HeLa細(xì)胞中表達(dá)含量較低[21，37]。將C1、C2和C3傳感器和對(duì)應(yīng)的Fuel與上述兩種固定細(xì)胞分別孵育6、8和12 h后的細(xì)胞熒光成像圖如圖9所示， 22Rv1細(xì)胞與3組傳感器孵育后均有明顯的熒光成像信號(hào)， 并隨著每一次核酸循環(huán)體系的疊加， 熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng); C1傳感器在HeLa細(xì)胞中并沒(méi)有明顯的QDs熒光成像信號(hào)，這是因?yàn)镠eLa細(xì)胞中miR-141表達(dá)含量比較低[38]， 其含量低于C1傳感器檢測(cè)限。選取相應(yīng)的傳感器定量檢測(cè)兩種細(xì)胞中miR -141的含量（表2），并與文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，提取RNA定量檢測(cè)miR -141的拷貝量與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的值相接近[21，37～39]。

4 結(jié) 論

通過(guò)將核酸循環(huán)體系疊加，開發(fā)了新型納米傳感器，與常規(guī)的納米傳感器相比，串聯(lián)的納米傳感器具有動(dòng)態(tài)可調(diào)的線性檢測(cè)區(qū)間和檢測(cè)限，可用于靈敏檢測(cè)癌細(xì)胞中不同表達(dá)水平的miRNA分子。雖然通過(guò)串聯(lián)核酸循環(huán)能夠放大檢測(cè)信號(hào)，但伴隨著信號(hào)的放大，傳感器的背景信號(hào)也隨之增大，影響串聯(lián)傳感器的靈敏度的提高。 后續(xù)研究將對(duì)傳感器背景信號(hào)增加的原因進(jìn)行分析，進(jìn)一步提高串聯(lián)傳感器的靈敏度。

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