任繁棟　丁筱雪　蔡芳　任達(dá)兵易倫朝　張宏

摘 要 采用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開展冠心病及冠心病合并2型糖尿病患者的血漿代謝組學(xué)研究，以探尋冠心病及冠心病合并2型糖尿病患者的代謝特征，為基于代謝組學(xué)的臨床治療方案優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。本研究鑒定出78種血漿中的內(nèi)源性代謝物。在代謝物定性與定量分析基礎(chǔ)上，結(jié)合偏最小二乘-判別分析和變量重要性投影等方法，篩選出20種區(qū)分健康人和冠心病患者的潛在特征代謝物、35種區(qū)分冠心病及冠心病合并2型糖尿病患者的潛在特征代謝物、37種區(qū)分健康人和冠心病合并2型糖尿病的潛在特征代謝物。代謝通路分析結(jié)果表明，氨基酸代謝在這兩類患者的生理代謝過程中發(fā)揮重要作用，而脂肪酸代謝很可能與冠心病合并2型糖尿病相關(guān)。

關(guān)鍵詞 冠心病; 冠心病合并2型糖尿病; 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù); 代謝組學(xué); 化學(xué)計(jì)量學(xué)

1 引 言

目前，冠心病（Coronary heart disease， CHD）是世界范圍內(nèi)危害最大的心血管疾病，也是我國成年人心臟病住院和死亡的首要原因[1～3]。近十年來，由于人口規(guī)模和老齡化程度加劇，冠心病的患病率逐年上升[4，5]。冠心病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的復(fù)雜性代謝紊亂疾病[6，7]。2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus， T2DM）是冠心病患者常見的合并癥。研究表明，冠心病合并2型糖尿?。–oronary heart disease-type 2 diabetes mellitus， CHD-T2DM）患者的死亡率遠(yuǎn)高于單純的冠心病患者[8]。揭示冠心病及冠心病合并2型糖尿病患者的代謝特征可幫助了解機(jī)體在病變過程中代謝的改變， 研究結(jié)果可輔助臨床治療方案的確定，有助于針對(duì)不同類型患者提出差異性的治療方案[4，9]。

代謝組學(xué)有助于全面了解生物系統(tǒng)中小分子代謝物在病理、生理刺激條件下的變化，是研究生命過程中內(nèi)源性小分子的有效手段[10～13]。近年來，代謝組學(xué)已應(yīng)用于冠心病的發(fā)病機(jī)理及臨床診斷等研究[14，15]。然而，代謝組學(xué)在冠心病合并2型糖尿病方面的研究報(bào)道仍較少。超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry， UPLC-HRMS）是代謝組學(xué)研究的有力工具[16]，如采用UPLC-HRMS靈敏快速地分析不同生物樣本中的25種氨基酸[17]，可快速定性與定量分析多種脂類物質(zhì)[18]，在2 min內(nèi)可檢測到二百余種細(xì)胞提取物中的主要代謝物[19]。由此可見，UPLC-HRMS可用于分析生物樣本中種類繁多的多種代謝物，具有高靈敏度、高分辨率、高通量的特點(diǎn)，可為代謝物的定性與定量分析提供豐富的信息。

本研究采用UPLC-HRMS技術(shù)對(duì)健康人（Healthy control， HC）、冠心病患者（CHD）及冠心病合并2型糖尿病患者（CHD-T2DM）進(jìn)行血漿代謝組學(xué)研究。在對(duì)代謝物進(jìn)行定性與定量分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合主成分分析（Principal component analysis， PCA）、偏最小二乘-判別分析（Partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA）[20]等方法對(duì)健康人與冠心病患者、冠心病與冠心病合并2型糖尿病患者、健康人與冠心病合并2型糖尿病患者進(jìn)行區(qū)分，并結(jié)合特征代謝物篩選和代謝通路分析，探尋冠心病及冠心病合并2型糖尿病患者的代謝特征。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Q-Exactive Focus軌道離子阱高分辨質(zhì)譜儀、UltiMate 3000超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）; 超聲波清洗機(jī)（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）; 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。乙腈、甲酸、甲醇（質(zhì)譜級(jí)，德國Merck公司）。21種標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%），其中，檸檬酸購自美國Supelco公司，溶血磷脂類物質(zhì)購自美國Avanti公司，其余的標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司。標(biāo)準(zhǔn)品的詳細(xì)信息見電子版文后支持信息表S1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品的采集與制備 51例健康人、21例冠心病患者和16例冠心病合并2型糖尿病患者，共88個(gè)血漿樣本收集于云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科。入組的患者，冠狀動(dòng)脈造影單支血管狹窄>50%[21]。冠心病合并2型糖尿病患者除依據(jù)冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)外，結(jié)合2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)入組。此組患者清晨空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L，75 g葡萄糖攝入2 h后血糖 ≥11.1 mmol/L [22]。研究中，排除了患有器質(zhì)性心臟病、肝功能不全、嚴(yán)重感染或惡性腫瘤、甲亢或任何其他自身免疫性疾病的參與者。血漿樣本均在清晨，空腹8 h后，經(jīng)由肘靜脈采取（肝素鋰抗凝），4℃靜置3 h，以3000 r/min離心20 min，取上清液，-80℃凍存。具體的樣本信息如表1所示。此項(xiàng)目通過云南省第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，參與人員均已簽署知情同意書。

2.2.2 血漿樣本前處理 將血漿樣本從-80℃取出，緩慢解凍并渦旋1 min，取20 μL轉(zhuǎn)移至離心管中，加入500 μL冷的質(zhì)譜級(jí)甲醇和10 μL 1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)（2-異丙基蘋果酸）溶液，渦旋1 min，室溫靜置10 min，在4℃條件下，14500 r/min離心10 min，取上清液，在室溫下用氮?dú)獯蹈桑褂?00 μL 質(zhì)譜級(jí)甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，并轉(zhuǎn)入帶有內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。

質(zhì)量控制樣本（Quality control， QC）的制備： 從88個(gè)血漿樣本中各取2 μL并混合均勻，加入1000 μL冷的質(zhì)譜級(jí)甲醇沉淀蛋白，后續(xù)處理步驟與血漿樣本的處理過程一致。將其作為QC樣本。測定過程中，每隔3個(gè)樣本進(jìn)一針QC樣本，QC樣本共進(jìn)樣29次，用于評(píng)價(jià)整個(gè)分析過程儀器和樣本的穩(wěn)定性[23]。

2.2.3 色譜條件 超高效液相色譜系統(tǒng)使用 ACE UPLC C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，3 μm）進(jìn)行反相分離。 流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸溶液， 流動(dòng)相B為乙腈。流速： 0.20 mL/min。柱溫： 40℃，進(jìn)樣體積： 1 μL。梯度洗脫： 2～9 min，5%～38% B; 9～14 min，38%～68% B; 14～22 min，68%～100% B; 22～30 min，100%～5% B。

2.2.4 質(zhì)譜條件 高分辨質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下： 離子源采用電噴霧電離源，噴霧電壓： 3500 V（-），4000 V（+）; 霧化溫度： 300℃; 霧化氣（鞘氣）壓力： 4.5 MPa（+），4.0 MPa （-）; 輔助氣壓力： 1.5 MPa（+），1.0 MPa（-）; 傳輸毛細(xì)管溫度：350℃（+），320℃（-）; 掃描模式： 全掃描（Full MS），分辨率35000，源內(nèi)誘導(dǎo)裂解電壓0 eV; 數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（ddms2），分辨率17500，高能碰撞誘導(dǎo)電壓： 15、25和35 eV。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理 代謝物定性分析： 對(duì)于有標(biāo)準(zhǔn)品的代謝物，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及保留時(shí)間比對(duì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中代謝物的準(zhǔn)確定性分析。對(duì)于其它的質(zhì)譜特征，通過分析一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配，如Mass Bank、人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（HMDB）等實(shí)現(xiàn)定性分析。

代謝物定量分析： MZmine是目前分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用最廣泛的一種工具，其運(yùn)行相對(duì)穩(wěn)定，操作簡單，對(duì)計(jì)算機(jī)性能的要求相對(duì)較低，可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地處理[24]。本研究基于定性的78種血漿內(nèi)源性代謝物，使用MZmine2.32提取其保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰強(qiáng)度及峰面積，MZmine2.32的具體參數(shù)見電子版文后支持信息表S2， 并采用內(nèi)標(biāo)法[25]實(shí)現(xiàn)78種代謝物的相對(duì)定量分析。

分類模型的建立： 使用MATLAB軟件和實(shí)驗(yàn)室自編的PCA程序分析了QC、HC、CHD及CHD-T2DM的聚類情況。在此基礎(chǔ)上，使用實(shí)驗(yàn)室自編的PLS-DA程序建立HC與CHD、CHD與CHD-T2DM及HC與CHD-T2DM的兩兩分類模型。數(shù)據(jù)經(jīng)過自標(biāo)度化（Autoscaling）預(yù)處理，并由十折交互檢驗(yàn)得到最佳潛變量數(shù)（optPC），使用ROC（Receiver operating characteristic）曲線的曲線下面積（Area under curve， AUC）判斷模型的質(zhì)量[8]。

特征代謝物篩選： 在PLS-DA模型的基礎(chǔ)上，將變量重要性投影（Variable importance projection， VIP）與AUC值相結(jié)合篩選特征代謝物[26]。PLS-DA模型中，某個(gè)變量（代謝物）的VIP值越大，代表該變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)就越大。將變量的VIP值進(jìn)行排序，再通過比較不同變量組合的分類能力，選取最佳的變量個(gè)數(shù)。具體方法如下： 對(duì)變量的VIP值排序，選取的第一個(gè)組合為VIP值最大的變量，第二個(gè)組合是VIP值最大的變量加上第二個(gè)變量，第三個(gè)組合是前三個(gè)變量，以此類推。隨著變量增多，AUC值逐漸增大，當(dāng)變量組合到一定數(shù)目時(shí)，AUC值達(dá)到最大，并且隨著變量個(gè)數(shù)的增加，AUC值不再增大。

代謝通路分析： 采用網(wǎng)絡(luò)版的MetaboAnalyst[27] （https：//www.metaboanalyst.ca/）分析相關(guān)代謝通路。具體的操作過程如下： 將上述得到的特征代謝物名稱輸入至MetaboAnalyst的Pathway Analysis中; 在Over Representation Analysis中選擇Hypergeometric Test算法，Pathway Topology Analysis用Relative-betweeness Centrality算法。最后進(jìn)行代謝通路匹配，得到代謝通路圖，其中橫坐標(biāo)代表代謝通路的影響值（Pathway impact），縱坐標(biāo)顯示了富集分析（Enrichment analysis）的P值。

3 結(jié)果與討論

3.1 代謝物的定性與定量分析

首先通過QC樣本評(píng)估UPLC-HRMS數(shù)據(jù)的質(zhì)量[28]。主成分分析的結(jié)果表明（見電子版文后支持信息圖S1），QC樣本分布在HC、CHD、CHD-T2DM的樣本分布范圍內(nèi)，且聚類效果良好，說明數(shù)據(jù)的采集具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和數(shù)據(jù)庫，從HC、CHD、CHD-T2DM的血漿樣本中共定性分析出78種內(nèi)源性代謝物（見電子版文后支持信息表S3）。其中，20種代謝物通過標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性歸屬，58種代謝物通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫以及代謝物的色譜和質(zhì)譜特征進(jìn)行定性歸屬。

使用MZmine2.32提取88個(gè)血漿樣本中78種代謝物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰強(qiáng)度及峰面積，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量分析。從總離子流圖（Total ion chromatograms， TIC）的直觀比較可見，一些譜峰在三類樣本間存在明顯的差異（見圖1）。采用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各內(nèi)源性代謝物在HC與CHD、CHD與CHD-T2DM、HC與CHD-T2DM的血漿中是否有顯著性差異。結(jié)果表明，78種代謝物中，有3種代謝物在HC與CHD間存在顯著性差異，9種代謝物在CHD與CHD-T2DM間存在顯著性差異，17種代謝物在HC與CHD-T2DM間存在顯著性差異（見電子版文后支持信息表S3）。

3.2 特征差異性代謝物篩選

采用PLS-DA方法建立HC與CHD的分類模型，AUC值為95.24%（表2）。在此基礎(chǔ)上，采用VIP方法篩選特征差異性代謝物。當(dāng)以VIP值最大的甘氨熊去氧膽酸（Glycoursodeoxycholic acid）作為第一個(gè)變量組合時(shí)，建立模型的十折交互檢驗(yàn)的AUC值僅為60.78%，隨著變量增多，AUC值逐漸增加，當(dāng)代謝物增加到20種時(shí)，AUC值為94.77%（表2），并且隨著變量數(shù)增加，AUC值呈相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)（圖2A）。最終篩選出區(qū)分HC與CHD的20種特征差異性代謝物（見電子版文后支持信息表S3）。

采用PLS-DA方法建立CHD與CHD-T2DM的分類模型，AUC值為92.86%（表2）。采用同樣的方法篩選特征差異性代謝物，以VIP值最大的代謝物2-戊酮酸（Ketovaleric acid）作為第一個(gè)變量組合時(shí)，AUC值為55.36%，當(dāng)變量組合增加到35個(gè)時(shí)，PLS-DA模型的AUC值為93.15%（表2），并且隨著變量數(shù)增多，AUC值呈穩(wěn)定趨勢（圖2B）。最終篩選出區(qū)分CHD與CHD-T2DM的35種潛在特征差異性代謝物（見電子版文后支持信息表S3）。

采用PLS-DA方法建立HC與CHD-T2DM的分類模型，AUC值為93.75%（表2）。以VIP值最大的代謝物吡咯烷（Pyrrolidine）作為第一個(gè)變量組合時(shí)，AUC值為69.30%，當(dāng)變量組合增加到37個(gè)時(shí)，PLS-DA模型的AUC值為93.63%（表2），并且隨著變量數(shù)增多，AUC值呈穩(wěn)定趨勢（圖2C）。最終篩選出區(qū)分HC與CHD-T2DM的37種潛在特征差異性代謝物（見電子版文后支持信息表S3）。

3.3 代謝通路分析

將區(qū)分HC與CHD的20種特征代謝物、區(qū)分CHD與CHD-T2DM的35種特征代謝物和區(qū)分HC與CHD-T2DM的37種特征代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst中進(jìn)行相關(guān)代謝通路分析（圖3）。由圖3可知，在HC與CHD中，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，氨酰生物合成，這4個(gè)生物代謝途徑對(duì)冠心病的影響比較大（圖3A）; 在CHD與CHD-T2DM中，亞油酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，泛酸鹽和乙酰輔酶A的生物合成，這3個(gè)生物代謝途徑的影響較大（圖3B）; 在HC與CHD-T2DM中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，亞油酸代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，這5個(gè)生物代謝途徑影響較大（圖3C）。

甘氨酸在代謝過程中，可轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸、甘胺膽酸、膽堿、肌酸等，其中，膽堿在生物體內(nèi)通過與二酰甘油結(jié)合生成磷脂酰膽堿。絲氨酸經(jīng)過脫羧反應(yīng)生成膽胺，膽胺甲基化后與膽堿激酶結(jié)合生成磷酸膽堿。磷酸膽堿類物質(zhì)合成異?？稍黾踊夹难芗膊〉娘L(fēng)險(xiǎn)[29]。精氨酸是動(dòng)物細(xì)胞中用途最廣泛的一種氨基酸，可作為合成NO的前體物質(zhì)。NO是重要的內(nèi)皮源性舒張因子（Endothelium-derived relaxing factor， EDRF），可擴(kuò)張血管，有效降低冠心病的發(fā)病率。有研究指出，在大鼠實(shí)驗(yàn)中增加精氨酸的量，還可顯著降低脂肪含量[30]。丙氨酸經(jīng)過轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生的丙酮酸，可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟牵€可生成谷氨酸。谷氨酸代謝異常與冠心病合并2型糖尿病密切相關(guān)[31]。

總體而言，氨基酸不僅是酶的重要底物，而且是重要的調(diào)節(jié)因子，包含反映身體新陳代謝和功能狀態(tài)的重要生化信息[32]。氨基酸代謝在冠心病患者的生理代謝中起重要作用[33]，在人體內(nèi)分解，可通過脫氨產(chǎn)生酮酸和氨。生成的酮酸可轉(zhuǎn)變成糖及脂肪，此過程是由酮酸在代謝過程中產(chǎn)生乙酰輔酶A，乙酰輔酶A可合成脂肪酸。脂肪酸可通過與甘油結(jié)合生成脂肪，而脂質(zhì)積累和聚集與冠心病的主要病因動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切[30]。機(jī)體內(nèi)氨基酸通過脫氨反應(yīng)生成的氨，在血液中并不是以游離的NH3形式存在的，而是通過氨酰生物合成的產(chǎn)物在血液中運(yùn)輸。在氨基酸的分解代謝中，有的酮酸具有產(chǎn)生糖的潛力，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸為生糖氨基酸。生糖氨基酸不僅可生成糖，還可直接或間接生成丙酮酸，丙酮酸不但可轉(zhuǎn)變?yōu)楦视?，而且也可在氧化脫羧后變成乙酰輔酶A從而生成脂肪酸。近年來一些研究表明，精氨酸和脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，丙酮酸代謝，這4個(gè)代謝通路受到干擾可能導(dǎo)致冠心病合并2型糖尿病的發(fā)生[31]。由此可知，氨基酸代謝對(duì)冠心病合并2型糖尿病的發(fā)生具有重要影響[30]。

除此之外，脂肪酸代謝可能由于脂質(zhì)代謝異常使體內(nèi)積累大量酮體，脂肪酸的β氧化進(jìn)程減慢，減少了乙酰輔酶A的生成，從而影響三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致糖代謝出現(xiàn)異常，所以脂肪酸代謝在冠心病合并2型糖尿病患者中也可能起重要作用。在人體內(nèi)脂肪酸可通過一系列生化反應(yīng)生成膽固醇，膽固醇代謝異?？蓪?dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究利用 UPLC-HRMS的高通量分析優(yōu)勢，檢測出78種血漿內(nèi)源性代謝物。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合PLS-DA和VIP法，篩選出區(qū)分健康人與冠心病患者的20種潛在特征代謝物，區(qū)分冠心病和冠心病合并2型糖尿病患者的35種潛在特征代謝物，區(qū)分健康人和冠心病合并2型糖尿病患者的37種潛在特征代謝物。代謝通路分析表明，氨基酸代謝很可能對(duì)冠心病的病變發(fā)展起重要作用，而脂肪酸代謝對(duì)冠心病合并2型糖尿病患者的代謝紊亂也可能起重要作用。本研究結(jié)果為深入研究冠心病及其合并癥的代謝紊亂問題提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為基于代謝組學(xué)的臨床治療方案優(yōu)化提供了有價(jià)值的信息。

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Abstract Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry was used in plasma metabolomics study of patients with coronary heart disease and coronary heart disease-type 2 diabetes mellitus. The aim was to explore the metabolic characteristics of coronary heart disease and coronary heart disease-type 2 diabetes mellitus， which would be useful for the optimization of clinical treatment plans based on metabolomics. A total of 78 endogenous metabolites were analyzed in plasma. On this basis， combined with partial least squares-discriminant analysis and variable importance projection， 20 characteristic metabolites were screened to distinguish healthy control from patients with coronary heart disease， 35 metabolites were screened for discrimination of patients with coronary heart disease and coronary heart disease-type 2 diabetes mellitus， 37 metabolites were screened to distinguish healthy control from patients with coronary heart disease-type 2 diabetes mellitus. Metabolic pathway analysis showed that amino acid metabolism played an important role in the physiological metabolism of these two types of patients， and fatty acid metabolism was likely to be associated with the complication of type 2 diabetes mellitus.

Keywords Coronary heart disease; Coronary heart disease-type 2 diabetes mellitus; Ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; Metabolomics; Chemometrics