武紅 李楓 張曦輝 王軍 張占薪

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是一種常見(jiàn)的惡性婦科腫瘤，在世界范圍內(nèi)死亡率較高［1］。因缺乏有效的篩查策略，近70%患者于中晚期時(shí)才被診斷出OC，導(dǎo)致5年生存率相對(duì)較低［2］。盡管針對(duì)OC 的手術(shù)和化療已有很大改善，但總體生存率仍較低［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是源自內(nèi)源染色體的非編碼RNA，其由15～22 個(gè)核苷酸組成，在OC 中miRNA 的異常表達(dá)起著促癌或抑癌作用［4］。其中miR-370-3p 在結(jié)腸癌、膽管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌和膀胱癌等中起抑制作用［5］。研究表明，miR-370通過(guò)對(duì)內(nèi)皮糖蛋白（endoglin，ENG）的負(fù)調(diào)控抑制子宮內(nèi)膜樣OC 的增殖，促進(jìn)子宮內(nèi)膜樣OC 對(duì)順鉑（cisplatin，cDDP）的化學(xué)敏感性［6］。本文旨在研究miR-370-3p 對(duì)OC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝的作用及機(jī)制，以期對(duì)OC診斷和治療的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 選取2017年2月至2019年2月23例于鄭州人民醫(yī)院行OC切除術(shù)患者的組織標(biāo)本，年齡29～63歲，根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)（2014年）分為Ⅰ期1例、Ⅱ期10例、Ⅲ期11例、Ⅳ期1例。本研究通過(guò)本院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者知情同意。

1.1.2 細(xì)胞和裸鼠 正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC和5 種OC 細(xì)胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、CaOV-3和A2780均購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司，所有細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 Ug/mL 的鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，溫度37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。12 只裸鼠購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司［許可證：SYXK（川）2017-203］，在溫度（25±3）℃，濕度60%，白天/夜晚各12 h，并自由采食的條件下飼養(yǎng)，分為對(duì)照組、miR-370-3p模擬物組、pc-HDAC4 組、miR-370-3p 模擬物+pc-HDAC4組，每組3只。

1.1.3 主要試劑 miR-NC、pc-NC、miR-370-3p 模擬物、pc-HDAC4質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)所用各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海慧穎生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海易色醫(yī)療科技有限公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司；miRNeasy 試劑盒購(gòu)自南京新科元生物技術(shù)有限公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Master Mix 購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBR-Green PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Ki-67、PCNA、裂解caspase3、Bax、HDAC4、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔來(lái)源的單克隆抗體一抗購(gòu)自上海艾博抗生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測(cè) 使用miRNeasy試劑盒從組織和細(xì)胞系中提取總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix Kit將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按SYBR-Green PCR試劑盒說(shuō)明擴(kuò)增并檢測(cè)mRNA。引物序列：U6上游為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-370-3p上游為5′-TAGCGGGTTTTGCTAGGGC-3′，下游為5′-TAGC GCCTAGGGCATCGATC-3′；HDAC4 上游為5′-AGCGT CCGTTGGATGTCA-3′，下游為5′-GGGCAAGGATGGC GATGT-3′。使用2-ΔΔct方法，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)基因）-ΔCt（目的基因）。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入1×106/mL 細(xì)胞液0.1 mL/孔，接種于6 孔板。達(dá)到80%融合時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)將100 μL 的miR-NC、pc-NC、miR-370-3p 模擬物、pc-HDAC4 質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入SKOV3細(xì)胞。

1.2.3 雙熒光素酶試驗(yàn) 將1 μg螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體HDAC4野生型（WT）或PGL3-HDAC4-突變型（MUT）以及miR-370-3p模擬物或miR-NC和PRLCMV 海藻熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，SKOV3細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶的相對(duì)活性。

1.2.4 蛋白印跡法檢測(cè) 使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE 分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，然后脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，加入一抗在4℃封閉過(guò)夜，再加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，使用Quantity One 軟件進(jìn)行分析蛋白條帶灰度。

1.2.5 CCK-8檢測(cè) 加入1×106/mL細(xì)胞液0.1 mL/孔，接種于96 孔板中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入CCK-8溶液10 μL/孔，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 按照1×106/mL的細(xì)胞濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μL 的Annexin-V-FITC 和5 μL 的PI，避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Seahorse XF24 檢測(cè) 加入1×106/mL 細(xì)胞液0.1 mL/孔，接種在Seahorse 平板中，孵育過(guò)夜，并在Seahorse 緩沖液中洗滌。在培養(yǎng)期間的不同時(shí)間中分別加入175 μL的Seahorse緩沖液，其中含10 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L 寡霉素和100 mmol/L 2-DG 緩沖液測(cè)定細(xì)胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），含1 μmol/L寡霉素、1 μmol/L碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙（FCCP）和1 μmol/L魚(yú)藤酮緩沖液測(cè)定氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）。葡萄糖處理后的ECAR 表明糖酵解速率，寡霉素處理后的ECAR表明其糖酵解能力，寡霉素處理前的耗氧量為基礎(chǔ)呼吸率，F(xiàn)CCP處理后的耗氧量為最大呼吸速率。

1.2.7 移植瘤免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 在各組裸鼠左腋皮下注射0.5 mL 轉(zhuǎn)染慢病毒SKOV3 細(xì)胞，濃度為5×104/mL。第30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，測(cè)定移植瘤體積和重量。對(duì)移植瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，石蠟包埋，脫蠟水化，過(guò)氧化物酶阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng)，分別加入一抗Ki-67 和caspase-3 單克隆抗體，4℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，DAB 顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料采用表達(dá)，Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。采用One-Way ANOVA分析進(jìn)行多組比較，采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OC 組織和細(xì)胞中miR-370-3p 和HDAC4 表達(dá)量

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與正常組織相比，OC組織中的miR-370-3p mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，HDAC4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01）；與HOSEpiC相比，OC細(xì)胞系中的miR-370-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，HDAC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01，圖1）。

2.2 SKOV3細(xì)胞中miR-370-3p和HDAC4靶向關(guān)系

選擇SKOV3細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與miR-NC組相比，miR-370-3p模擬物組的miR-370-3p mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）。蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-370-3p模擬物組的HDAC4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），pc-HDAC4組的HDAC4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與miR-370-3p模擬物組相比，miR-370-3p模擬物+pc-HDAC4組的HDAC4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-370-3p與HDAC4在3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-370-3p與HDAC4-野生型共轉(zhuǎn)染顯著降低熒光素酶活性（P＜0.01），miR-370-3p靶向下調(diào)HDAC4（圖2）。

圖1 OC組織和細(xì)胞中的miR-370-3p和HDAC4相對(duì)表達(dá)量

圖2 SKOV3細(xì)胞中miR-370-3p和HDAC4靶向關(guān)系

2.3 miR-370-3p對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK-8、蛋白印跡法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-370-3p模擬物組的細(xì)胞增殖顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡顯著上調(diào)，PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，裂解caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），而pc-HDAC4 組的SKOV3 細(xì)胞增殖顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡顯著下調(diào)，PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，裂解caspase-3 和Bax 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05 和P＜0.01）。與miR-370-3p 模擬物組相比，miR-370-3p 模擬物+pc-HDAC4 組的細(xì)胞增殖顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡顯著下調(diào)，PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，裂解caspase-3和Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制SKOV3細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖3）。

2.4 miR-370-3p 對(duì)SKOV3 細(xì)胞糖酵解能力和線粒體功能的影響

Seahorse XF24檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-370-3p模擬物組的SKOV3細(xì)胞糖酵解速率和糖酵解能力顯著下調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著上調(diào)（P＜0.01），而pc-HDAC4組的SKOV3細(xì)胞糖酵解速率和糖酵解能力顯著上調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著下調(diào)（P＜0.01）。與miR-370-3p模擬物組相比，miR-370-3p模擬物+pc-HDAC4組的SKOV3細(xì)胞糖酵解速率和糖酵解能力顯著上調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著下調(diào)（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制SKOV3細(xì)胞代謝（圖4）。

2.5 miR-370-3p對(duì)SKOV3移植瘤的影響

免疫組織化學(xué)法和Seahorse XF24檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-370-3p模擬物組的SKOV3移植瘤體積和重量顯著下調(diào)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著上調(diào)，caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著下調(diào)，糖酵解速率和糖酵解能力顯著下調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著上調(diào)（P＜0.01）；pc-HDAC4組的SKOV3移植瘤體積和重量顯著上調(diào)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著下調(diào)，caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著上調(diào)，糖酵解速率和糖酵解能力顯著上調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著下調(diào)（P＜0.01）。與miR-370-3p模擬物組相比，miR-370-3p模擬物+pc-HDAC4組的SKOV3移植瘤體積和重量顯著上調(diào)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著下調(diào)，caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著上調(diào)，糖酵解速率和糖酵解能力顯著上調(diào)，基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率顯著下調(diào)（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制移植瘤生長(zhǎng)（圖5）。

圖5 miR-370-3p對(duì)SKOV3移植瘤的影響

3 討論

本研究表明miR-370-3p 過(guò)表達(dá)抑制OC 的發(fā)展，與Li等［7］研究相一致。研究表明，miR-370-3p通過(guò)抑制PDLIM1/Wnt/β-catenin 信號(hào)來(lái)抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC4是Ⅱ類(lèi)組蛋白脫乙?；?，其表達(dá)在不同組織和器官中具有差異性，在腫瘤的發(fā)展和預(yù)后中具有重要作用。在食管癌中，HDAC4 過(guò)表達(dá)與生存不良相關(guān)，并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［9］，且HDAC4 通過(guò)p21 抑制胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡［10］。miR-520b 通過(guò)靶向HDAC4 抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)［11］。在本研究的OC 組織和細(xì)胞中，miR-370-3p 低表達(dá)、HDAC4 高表達(dá)，miR-370-3p 靶向下調(diào)HDAC4 表達(dá)；miR-370-3p過(guò)表達(dá)減少細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡，下調(diào)PCNA 和Ki-67蛋白表達(dá)，裂解caspase-3和Bax 蛋白表達(dá)。表明miR-370-3p 通過(guò)靶向下調(diào)HDAC4 抑制OC細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

為了滿足癌細(xì)胞增殖的能量需求，細(xì)胞代謝模式從線粒體呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒猓?2］。研究表明，肌肽通過(guò)線粒體呼吸和糖酵解途徑抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖［13］。并且除了通過(guò)改變代謝影響細(xì)胞增殖外，還有利于避免細(xì)胞凋亡［14］。miR-422a 過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向胃癌中的丙酮酸脫氫酶激酶2 降低糖酵解能力并增強(qiáng)呼吸能力，抑制胃癌的惡化［15］。本研究中的miR-370-3p 過(guò)表達(dá)，降低OC 細(xì)胞的糖酵解速率和糖酵解能力，并升高基礎(chǔ)呼吸速率和最大呼吸速率，表明miR-370-3p通過(guò)靶向下調(diào)HDAC4調(diào)節(jié)OC細(xì)胞的代謝。

綜上所述，miR-370-3p 通過(guò)靶向下調(diào)HDAC4，抑制OC 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并改變OC 細(xì)胞的代謝。這說(shuō)明miR-370-3p和HDAC4可成為治療和預(yù)防OC的潛在靶點(diǎn)。本研究?jī)H對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探討，更為詳細(xì)的分子通路機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。