胡曉光 陳燦燦 張亞男 馬俊揚 陳偉

結核分枝桿菌(MTB)通過多種機制逃避和破壞宿主的細胞免疫反應，使其能在宿主體內持續(xù)建立感染。但是，目前尚不完全清楚機體對MTB復雜的細胞免疫過程。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染是結核病進展的最大風險因素之一[1]，并發(fā)HIV感染使?jié)摲Y核感染(LTBI)進展成為活動性結核病(ATB)的風險從5%～10%的終生風險提高到10%的年風險。

卡介苗(BCG)在預防兒童和成年人肺結核方面效果不穩(wěn)定[2]，且免疫學機制尚不完全清楚。此外，長期以來關于理想結核病疫苗的觀點認為，結核病疫苗的免疫反應本質應該是刺激機體產生抗原特異性CD4+T淋巴細胞分泌γ干擾素(IFN-γ)[3]。隨著近年來對宿主感染MTB后產生免疫反應的了解不斷加深，利用MTB感染免疫學的知識改進結核病治療方法和疫苗的機會也在增加。提高對MTB與宿主免疫細胞之間復雜的相互作用的認識，對于開發(fā)有效的結核病疫苗至關重要。

一、MTB抵抗巨噬細胞的吞噬作用

巨噬細胞是感染過程中最先遇到MTB的免疫細胞，也是結核病的主要宿主細胞。巨噬細胞識別MTB后將其吞噬并將細菌隔離在吞噬體中，吞噬體通常通過與溶酶體融合后酸化來消滅病原體。然而，MTB能夠通過多種機制抑制吞噬體成熟和吞噬溶酶體生成，從而在吞噬體中存活和增殖[4]。

MTB糖脂可以阻止磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)在吞噬體膜上的累積，并阻止吞噬溶酶體的形成[5]。MTB還可以分泌磷酸酶(SapM和PtpA)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(PknG)干擾吞噬體成熟[6]。MTB的ESX-1分泌系統(tǒng)也可以破壞宿主細胞吞噬體的完整性，從而阻止吞噬體成熟[7]，ESX-1介導的噬菌體逃逸被認為是通過結核分枝桿菌早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)破壞噬菌體而發(fā)揮逃逸作用[8-9]。MTB的ESX-3分泌系統(tǒng)還可以通過抑制轉運所需的宿主內吞體分選復合物，參與調節(jié)細胞內細菌的轉運，以抑制吞噬體成熟[10]。以上研究表明，ESX分泌系統(tǒng)在細菌逃避吞噬體方面可能能夠發(fā)揮作用。除了ESX系統(tǒng)，MTB還能表達參與蛋白分泌的2個SecA atp酶同源蛋白SecA1和SecA2[11]，MTB和BCG的ΔsecA2突變體都能縮短宿主細胞吞噬體的酸化時間，表明SecA2是抑制吞噬體成熟的必要條件[12]。

MTB通過不同的受體進入巨噬細胞，可導致抑制或促進細菌增殖的不同途徑被激活。例如，補體受體3(CR3)對MTB的吸收依賴于宿主膽固醇，而膽固醇通過激活宿主鈣調蛋白[13]，介導與吞噬體和冠蛋白-1的結合及一氧化氮合酶2(NOS2)信號基因轉錄，產生一氧化氮(NO)[14]。宿主體內NO的水平與機體抗結核作用密切相關，在小鼠模型中NO抗結核作用的證據(jù)更充分。在小鼠中，活性氮中間體(RNI)在體外對分枝桿菌具有毒性[15]，抑制一氧化氮合酶(NOS)會導致感染加重。雖然在人類肺泡巨噬細胞和原代單核細胞的體外研究中沒有發(fā)現(xiàn)NO的抗分枝桿菌作用[16]，但與健康對照人群相比，結核感染者體內NOS2表達明顯上調[17]。

二、MTB感染中自然殺傷(NK)細胞的作用

NK細胞是具有分泌IFN-γ和溶細胞功能的先天淋巴細胞。MTB細胞壁的各種成分可直接與NK細胞上的NKp44受體結合[18]。NK細胞本身不表達特異性抗原識別受體，但可通過識別MTB感染的細胞表面表達上調的受體分子(如MHC Ⅰ類分子)，從而直接殺傷感染的靶細胞[19]。NK細胞可直接殺死已感染MTB的巨噬細胞[20]，但還可以通過分泌白細胞介素(IL)-22和IFN-γ限制細胞內細菌的增殖[21]。此外，NK細胞可以通過提高CD8+T淋巴細胞產生IFN-γ的水平[22]，促進γδT細胞的增殖[23]，間接增強對MTB的免疫力。接種BCG后，機體IL-21依賴的NK細胞亞群在MTB感染后出現(xiàn)上調的現(xiàn)象[24]，表明NK細胞可能也具有記憶細胞的一些顯著特征。

三、MTB感染人群炎癥期間腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的作用

中性粒細胞的聚集和活動可以幫助抑制細菌增殖，但是持續(xù)的中性粒細胞炎癥又可以破壞炎性反應的平衡，從而促使疾病進展。在小鼠模型和人類樣本中，過量的Ⅰ型干擾素信號已被證明會促進疾病的發(fā)生。Ⅰ型干擾素在MTB感染的致病作用包括抑制IL-1β[25]、IFN-γ對巨噬細胞的激活作用。

TNF-α是在抗結核免疫過程中至關重要的促炎細胞因子。機體TNF-α水平較低會表現(xiàn)出高度的結核易感性[26]。并發(fā)炎性疾病的LTBI人群在接受抗TNF-α治療炎性疾病后，LTBI向ATB進展的速度加快[27]，體現(xiàn)了TNF-α在抗結核過程中的關鍵免疫作用。小鼠感染MTB的組織病理學證據(jù)表明，TNF-α信號缺失對調節(jié)感染后細胞凋亡或壞死作用產生了影響[28]。

炎癥的調控是決定結核感染結局的關鍵因素。過度的炎癥會損傷細胞免疫過程，導致肺組織病理損傷。相反，炎癥反應不足會導致先天和適應性免疫誘導延遲，從而損害對細菌的免疫控制力。

四、MTB感染后CD4+ T淋巴細胞的主要作用

CD4+T淋巴細胞的水平是決定MTB感染后結局的一個關鍵因素。但是與其他病原體相比，MTB感染特異性CD4+T淋巴細胞反應通常在感染后2～3周才能被檢測到[29]，這種適應性免疫的啟動延遲可能是由多種因素引起的，包括細菌生長緩慢，感染的巨噬細胞和中性粒細胞的凋亡受到抑制，以及巨噬細胞的激活和遷移延遲，這些因素同時也會導致MTB在肺部建立持續(xù)感染。

CD4+T淋巴細胞與感染的巨噬細胞相互作用，抑制細胞內MTB復制。CD4+T淋巴細胞反應的有效性取決于抗原特異性CD4+T淋巴細胞從淋巴組織轉移到感染肺組織中的水平。

有研究證明，感染期間肺血管系統(tǒng)的細胞分泌的IFN-γ量最高[30]。還有研究表明，IFN-γ可以控制肺臟蔓延至脾臟的細菌負擔，同時IFN-γ的過表達又會加重免疫病理損傷[31]，提示IFN-γ有抑制細菌向肺外傳播的作用，但IFN-γ過表達也會對機體產生損傷。李美忠等[32]研究表明，CD4+T淋巴細胞的一個亞群——多功能輔助性T細胞(Th1)，其分泌的IFN-γ、IL-2等細胞因子在控制慢性感染中能夠發(fā)揮重要作用，Th1亦可作為評價疫苗接種效果的參考指標。

綜上所述，抗原特異性CD4+T淋巴細胞在對MTB的保護性免疫中發(fā)揮重要作用。

五、CD8+ T淋巴細胞在抗MTB感染中的作用

CD8+T淋巴細胞在抵抗MTB感染的免疫中同樣發(fā)揮著重要作用。與對照組相比，缺乏抗原加工轉運相關蛋白(TAP-1)的小鼠在感染MTB后，因小鼠CD8+T淋巴細胞反應缺陷而迅速死亡[33]。動物實驗表明，CD8+T淋巴細胞的耗竭會減弱BCG疫苗或化學干預措施的保護性免疫效果[34]，這表明CD8+T淋巴細胞是MTB感染免疫反應的重要組成部分。同樣，在化學藥品治療結核潛伏感染的小鼠模型中，CD8+T淋巴細胞可以抑制MTB的再激活[35]。CD8+T淋巴細胞在抗MTB感染過程中的作用與其分泌可抑制細菌增殖的細胞因子和細胞溶解效應分子有關。除了IFN-γ和TNF-α外，CD8+T淋巴細胞還可分泌穿孔素來裂解已感染MTB的巨噬細胞[36]。CD8+T淋巴細胞也可以釋放顆粒溶菌素，直接殺死細胞內的MTB[37]。類風濕關節(jié)炎患者使用抗TNF-α療法會消耗部分CD8+T淋巴細胞，這種現(xiàn)象部分解釋了為什么接受抗TNF-α治療的LTBI進展到ATB的風險會增加。另外，MTB的抗原——培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)[38]、ESAT-6[39]和Ag85復合體[40]能與人CD8+T淋巴細胞受體結合，激活免疫反應，但是結合位點集中于有限的一些抗原表位，通常受人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-B等位基因限制[41]。感染MTB的巨噬細胞凋亡可以促進MTB抗原向CD8+T淋巴細胞交叉呈遞。然而MTB可以抑制宿主細胞凋亡，以逃避CD8+T淋巴細胞誘導的有效應答。

綜上所述，CD8+T淋巴細胞是MTB感染適應性免疫的關鍵組成部分，并通過抑制潛伏期感染的再激活，以及在活動期間直接參與抗菌過程發(fā)揮重要作用。

六、記憶T細胞免疫反應

在LTBI和治愈的結核病患者中可以檢測到抗原特異性記憶T細胞反應。記憶T細胞亞群可以通過其細胞表面表型和功能特性進行識別，而抗原特異性記憶T細胞的不同群體可以根據(jù)其一系列細胞表面激活標志物和趨化因子受體的表達進行分類[42]。LTBI中MTB特異性記憶CD4+T淋巴細胞大部分是CD45RA-CCR7-表型的T效應記憶細胞[43]。LTBI個體進行MHC Ⅱ類四聚體觀察分析顯示，與健康對照組相比，LTBI的CD45RA-CCR7+中央記憶CD4 細胞表面趨化因子受體CXCR3、CCR6表達量增加[44]，顯示出CXCR3、 CCR6 受體在MTB感染時的特異性。

記憶CD4+T 淋巴細胞表型可能會根據(jù)抗原特異性、疾病狀態(tài)及識別特異性反應的方式而有所不同。在LTBI個體中，人類記憶CD8+T淋巴細胞主要是末端分化的效應記憶T細胞[45]。免疫記憶的小鼠T細胞在MTB感染后早期迅速增殖并分泌IFN-γ，雖然表現(xiàn)出明顯的保護效應但是保護周期較短[46]，表明原發(fā)性MTB感染后產生的記憶T細胞保護其免受再次感染的能力有限。

七、MTB感染期間的B細胞反應

有研究表明，體液免疫在抵抗MTB感染中起著重要作用[47]。在人肉芽腫的淋巴細胞中可以發(fā)現(xiàn)B細胞與T細胞并存[48]，全血基因表達分析顯示，結核病患者在抗結核治療后，B細胞相關基因發(fā)生了明顯變化[49]。人體外和小鼠感染模型試驗也顯示抗體能提供一定的保護作用[50]。利用高通量方法鑒定MTB蛋白質組中的抗體靶標揭示了活動性肺結核患者血漿中存在抗體識別的細胞外抗原[51]，表明B細胞積極參與了MTB感染后的免疫。MTB感染后，B細胞缺陷小鼠的嗜中性粒細胞聚集量增加并加重了肺部病理損傷[52]，這是由于B細胞缺陷或B細胞耗竭的小鼠IL-17反應增強介導的[53]。這些研究表明，B細胞可通過調節(jié)炎癥反應來影響MTB感染的結局?？贵w與B細胞表面抑制性受體FcγRⅡ-B的結合會減弱巨噬細胞產生IL-12并抑制Th1細胞的作用[54]，而將針對MTB細胞壁成分的單克隆抗體轉移至小鼠體內可以改善小鼠感染的結局[47]。

綜上所述，B細胞通過調節(jié)抗體和細胞因子的分泌來調節(jié)炎癥，從而在MTB感染的適應性免疫應答中發(fā)揮作用。

八、γδT細胞對MTB的免疫反應

γδT細胞是T細胞的一種亞群，可識別非肽抗原，如微生物代謝產物和磷抗原[55]，存在于包括肺在內的黏膜表面[56]。MTB感染單核細胞后可以激活γδT細胞的增殖[57]。人的γδT細胞可識別多種MTB代謝產物，包括焦磷酸鹽、異戊二烯基焦磷酸鹽衍生物和含三磷酸胸苷的化合物[58]。γδT細胞也可以對分枝桿菌熱休克蛋白產生反應[59]，接種BCG也可引起類似反應[60]。表達Vγ9Vδ2受體的γδT細胞占外周血中MTB反應性T細胞的很大比例[61]，并且可以限制巨噬細胞中細胞內MTB的增殖[62]。此外，人Vγ2Vδ2 T細胞可識別MTB[63]，在非人靈長類動物中，Vγ2Vδ2 T細胞可被磷抗原和IL-2刺激而增殖[64]。有研究表明，γδT細胞可通過分泌顆粒溶素和穿孔素或通過單核細胞誘導TNF-α介導直接殺死MTB[65-66]。

九、結核病并發(fā)HIV感染后T細胞功能受損

MTB的傳播受到多種因素的影響，包括與ATB患者的接觸程度和接觸時間，以及感染者自身的免疫力[67]。大多數(shù)人在接觸MTB后轉變?yōu)長TBI者，其中有5%～10%的LTBI者會發(fā)展為ATB。MTB感染的臨床診斷與治療常伴隨多種感染而導致復雜化。

HIV感染機體后，CD4+T淋巴細胞衰竭和功能障礙導致機體對MTB的免疫受到抑制。多項研究表明，結核病患者特異性T淋巴細胞的耗竭可能是CD4+T淋巴細胞中HIV的輔助受體，尤其是趨化因子受體CCR5表達增強的結果[68]。并發(fā)巨細胞病毒(CMV)感染的LTBI個體，MTB特異性CD4+T淋巴細胞分泌巨噬細胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)水平上升，而并發(fā)HIV感染的LTBI個體中，MTB特異性CD4+T淋巴細胞分泌水平明顯上升的細胞因子卻是IL-2[69]。對并發(fā)HIV感染的LTBI患者病毒載量的分析表明，病毒載量與分泌IL-2的MTB特異性CD4+T淋巴細胞的頻率呈負相關[70]，進一步說明產生IL-2的MTB特異性CD4+T淋巴細胞在并發(fā)HIV感染的情況下可能被特異性消耗。與此相關的是，與未感染HIV的LTBI者相比，感染HIV的患者CD4+T淋巴細胞的水平較低，而且增殖能力受損[71]，表明在HIV感染的過程中，MTB特異性CD4+T淋巴細胞功能發(fā)生障礙。此外，HIV感染可能會擾亂免疫細胞(如CD8+T淋巴細胞)對MTB的保護性免疫。據(jù)報道，與未感染HIV的個體相比，感染HIV的LTBI患者MTB特異性CD8+T淋巴細胞的增殖能力受損[72]。此外，MTB感染引起巨噬細胞分泌的TNF-α水平下降，更有利于HIV的增殖[73]。

綜上所述，結核病并發(fā)HIV感染者細胞功能受損，打破了免疫系統(tǒng)平衡，導致T細胞清除MTB和HIV的能力進一步降低。

十、總結與討論

通常情況下，大多數(shù)病原體在感染人體后，經過一系列的免疫反應，最終的結局是被人體內的巨噬細胞吞噬，接著被巨噬細胞內的溶酶體溶解，最終死亡。而MTB存在一種“免疫逃避”現(xiàn)象，能夠保護MTB在被巨噬細胞吞噬后逃避溶酶體的溶解。“免疫逃避”的機制目前尚不完全清楚，除了本文提到的MTB抑制氧化應激和巨噬細胞凋亡的機制以外，還有可能與巨噬細胞對IFN-γ刺激應答的敏感度被下調有關[74]；MTB存在ESAT-6和CFP-10，可以在細胞膜表面形成保護層，影響特異性反應，從而保護MTB在巨噬細胞中不被溶解，從而得以增殖[75]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，結核壞死性毒素(tuberculosis necrotizing toxin，TNT)可以水解巨噬細胞中一種重要的輔酶NAD+，導致巨噬細胞死亡，從而釋放出MTB來感染更多的細胞[76]。以上研究或許可以為MTB的“免疫逃避”機制提供解釋。

目前尚缺乏針對成年人的結核病疫苗，BCG可以預防嬰幼兒發(fā)生重癥結核病，但對于兒童或成年人的肺結核沒有明顯的保護作用。原因可能為：BCG不能預防原發(fā)感染，但卻可以改變人體的防御機制，機體在接種BCG 4～8周后會產生免疫力，這種免疫力可以在機體感染MTB后，抑制其繁殖和播散。但是這種獲得性免疫的持久性和MTB在體內的存活狀況相關，隨著體內MTB的消亡，機體的這種獲得性免疫也會隨著記憶性T淋巴細胞數(shù)量的減少及功能衰退而逐漸降低直至消失[77]，這種免疫被稱為帶菌免疫或傳染性免疫[78]；另一方面，BCG在傳代或去除毒力基因的減毒過程中，會使一些保護性抗原和免疫相關的基因丟失[79]，如Esx-1基因的缺失，可能是導致BCG在減毒的同時大大降低其保護效果的主要因素之一[80]。因此，BCG不能誘導終生免疫。目前世界范圍內處于臨床研究的結核病疫苗包括5種亞單位疫苗(AEC/BC02、M72/AS01E[81]、H4:IC31[82]、H56:IC31[83]和ID93/GLA-SE[84])、5種病毒載體疫苗(Ad5Ag85A[85]、MVA85A、ChAdOx1.85A/MVA85A[86]、MVA85A-IMX313[87]和TB/FLU-04L)，以及5種全細胞結核病疫苗(母牛分枝桿菌疫苗、DAR-901[88]、VPM1002、MTBVAC 和RUTI)。MVA85A是一種表達MTB的Ag85A抗原的安卡拉痘苗病毒，作為BCG的增效疫苗，雖然接種MVA85A增強了抗原特異性CD4+T淋巴細胞反應，但是最終結果未顯示出保護效果[89]。此外，最近的一項利用重組巨細胞病毒(CMV)的結核疫苗研究結果顯示出對恒河猴具有保護作用[90]。需要注意的是，人體以前接觸過載體病毒可能會減弱疫苗誘導的免疫反應并可能出現(xiàn)并發(fā)癥。VPM1002是一種提高BCG免疫原性的重組疫苗[91]；MTBVAC是一種基因減毒的MTB菌株，其phoP和fadD26基因的缺失破壞了MTB表面各種脂質的合成[92]；治療性候選疫苗RUTI是在壓力下將MTB滅活、破碎，去除有毒成分后放置于脂質體中制成的[93]；母牛分枝桿菌疫苗主要成分與MTB具有相同的免疫原性蛋白[94]，二者均能產生相應的特異性細胞和體液免疫，并存在交叉免疫反應[95]。

盡管越來越多的研究表明IFN-γ在抗結核過程中發(fā)揮重要作用，但是僅僅增強誘導IFN-γ的分泌不足以成為有效的結核病疫苗。研究證明，BCG誘導的特異性CD4、CD8和γ δ T細胞，與新生兒結核病的保護效果無相關性[96]。此外，由于約90%的MTB感染者在感染后處于潛伏狀態(tài)，因此研發(fā)用于LTBI的疫苗也至關重要[97]。在缺乏結核病疫苗的情況下，實現(xiàn)“終止結核病”充滿挑戰(zhàn)，了解MTB打破先天性免疫和適應性免疫狀態(tài)的機制，能為更好地開發(fā)新的結核病疫苗提供理論依據(jù)。

利益沖突本文內容僅為學術觀點，不涉及利益沖突。