李港 謝建平

截至 2020年5月12日，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)全球大流行(pandemic)已確診4 284 424 例，累計(jì)死亡283 493例。這種新型冠狀病毒最初于2020年1月12日被世界衛(wèi)生組織命名為 “2019新型冠狀病毒” (novel coronavirus 2019，2019-nCoV)。隨后在2020年2月11日，國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組根據(jù)系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)及慣例將其正式命名為“嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2”(SARS-CoV-2)[1-2]。

由于缺乏特效藥和疫苗，對癥治療有效率較低，治療周期長久，費(fèi)用高昂，不良反應(yīng)比較嚴(yán)重[3-6]。冠狀病毒的高度變異性使得治療和預(yù)防都面臨極大困難[7]。深入研究病毒生物學(xué)性質(zhì)，加速抗 SARS-CoV-2 的藥物和疫苗研制非常必要。近年來，特定靶向抗病毒治療(specifically targeted antiviral therapy for HCV，STAT-C)是抗病毒研究的一個重要方向[8]。與哺乳動物細(xì)胞或者其他病毒 DNA 序列的復(fù)制比較，RNA 病毒基因組復(fù)制未經(jīng)校讀(proofread)或者編輯(edit)，因此忠實(shí)性低。這是 RNA 病毒進(jìn)化快、適應(yīng)力強(qiáng)，容易流行的一個主要因素。RNA復(fù)制酶是冠狀病毒復(fù)制所需，也是其突變率高的分子基礎(chǔ)。筆者對 SARS-CoV-2 的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行概述，并總結(jié)了針對其他冠狀病毒的 RdRp 抑制劑。這可能為靶向 SARS-CoV-2 RdRp 的藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)。

一、冠狀病毒生物學(xué)性質(zhì)

冠狀病毒是有囊膜的正鏈 RNA 病毒，屬于巢病毒目(nidovirales)、冠狀病毒科(coronaviridae)、冠狀病毒亞科，分為 4 個屬(α、β、γ 和δ)，其中對人致病的主要是 α-和 β-屬病毒[9]。目前已知26種冠狀病毒感染威脅動物[10]。7種冠狀病毒可感染人類：其中，人冠狀病毒-229E (human coronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠狀病毒-NL63(human coronavirus NL63, HCoV-NL63)、人冠狀病毒-OC43 (human coronavirus，HCoV-OC43)、人冠狀病毒-HKU1 (human coronavirus，HCoV-HKU1) 4種冠狀病毒是人類常見病原體。2019 年 12 月出現(xiàn)的 SARS-CoV-2 是 β-屬冠狀病毒，與2003 年出現(xiàn)的 SARS-CoV、2012 年出現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)關(guān)系密切，都能引起致命的呼吸系統(tǒng)疾病[11]。冠狀病毒已成為全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅之一[12]。

冠狀病毒主要結(jié)構(gòu)包括：由囊膜包裹的病毒的核心，刺突糖蛋白 S、包膜蛋白 M 和小包膜蛋白 E 則定位在病毒囊膜表面，核衣殼蛋白 N 與病毒單鏈正義 RNA 基因組結(jié)合形成螺旋核衣殼，包裹在病毒囊膜內(nèi)側(cè)。冠狀病毒的基因組約 26～32 kb，是目前病毒中最大的單股正鏈 RNA 基因組，含有 7～16 個功能不同的可讀框(open reading frame，ORF)[13]?；蚪M RNA 5′端具有甲基化帽，3′端具有 poly-A 尾。冠狀病毒基因組是多順反子，5′端近2/3被2個大的重疊的開放閱讀框架 (ORF 1a和1b)占據(jù)，翻譯生成復(fù)制酶多聚蛋白 pp1a 和 pp1ab[14]。這2個多聚蛋白被2個或3個 ORF1a 編碼的蛋白酶切割，釋放出 16 個非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein, nsp1～nsp16)[15]。這些非結(jié)構(gòu)蛋白包括蛋白酶、RdRp、RNA 解旋酶、RNA 甲基化加帽酶、核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶等?；蚪M 3′端1/3的序列則按照固定的順序編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白：(HE)-S-E-M-N，以及各冠狀病毒特有的附屬蛋白。參與病毒復(fù)制的相關(guān)蛋白和病毒基因組形成復(fù)制/轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(replication and transcription complex，RTC)，病毒基因組 RNA (genomic RNA, gRNA)，負(fù)鏈亞基因組 RNA (sub-genomic RNA)和亞基因組 mRNA(sub-genomic mRNA)均由此復(fù)合體進(jìn)行復(fù)制/合成[16]。

冠狀病毒基因重組率和突變率高，適應(yīng)性強(qiáng)，致病性強(qiáng)。作為單股正鏈 RNA 病毒，冠狀病毒能直接以基因組 RNA 作為模板翻譯產(chǎn)生蛋白[17]。當(dāng)兩種冠狀病毒感染同一宿主時，雙方的基因組會發(fā)生成百上千堿基對的基因組片段交換，可能產(chǎn)生病毒變異[18]。這可能是近20年內(nèi)出現(xiàn) SARS-CoV，MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 三種冠狀病毒并大規(guī)模感染人類的一個主要因素。

二、冠狀病毒 RdRp 的結(jié)構(gòu)和功能

SARS-CoV-2 的 nsp12 是典型的 RdRp，也是催化病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的一個關(guān)鍵成分[19]。其結(jié)構(gòu)主要由4個結(jié)構(gòu)域組成：(1)V31-K50 殘基組成的一個 N 端 β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)域[20]；(2)D60-R249 殘基組成的類似于尼多病毒 RdRp 相關(guān)核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase，NiRAN)結(jié)構(gòu)的 N 端延伸結(jié)構(gòu)域[21]；(3)A250-F369 殘基組成的接口域(interface domain)；(4)S367-F920 殘基組成的“右手”聚合酶結(jié)構(gòu)域，其中又包括手指(fingers)、手掌(palm)、拇指(thumb)3個亞結(jié)構(gòu)域。Nsp12 的 N 端 β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)直接插入 RdRp 結(jié)構(gòu)域中的 NiRAN 結(jié)構(gòu)域和手掌亞結(jié)構(gòu)域夾持的凹槽中[20]。SARS-CoV-2 RdRp 結(jié)構(gòu)域的主要活性位點(diǎn)都處在手掌區(qū)中，由聚合酶基序(motif)A-G 形成，這些催化殘基在 RNA 病毒 RdRp 中普遍保守：其中基序 A 包含殘基 T611-M626;基序 B 包含殘基T680-T710; 基序 C 由殘基 F753-N767 構(gòu)成，包含一個保守性催化殘基(759-SDD-761); 基序 D 包含殘基 L775-E796; 基序 E 包含殘基 H810-V820; 基序 F 包含殘基 K912-E921; 基序 G 包含殘基 K500-S518[20, 22]。

在這個結(jié)構(gòu)中，4個帶正電荷的三磷酸核苷(NTP)可抵達(dá)的路徑匯聚到一個中心空腔中，在那里 RdRp 基序介導(dǎo)模板指導(dǎo)的 RNA 合成。NTP 進(jìn)入通道是由一組親水殘基組成的，包括基序 F 中的K545、R553 和 R555 等3個殘基。RNA 模板通過由基序 F 和 G 夾住的凹槽進(jìn)入由基序 A 和 C 組成的活性位點(diǎn)。拇指亞結(jié)構(gòu)域支撐引物鏈避免從模板鏈上脫落。產(chǎn)物-模板雜交物通過聚合酶前側(cè)的 RNA 出口隧道離開活性位點(diǎn)[20]。冠狀病毒攜帶的核糖核酸基因組(約30 kb)比大多數(shù)動物核糖核酸病毒(約3～15 kb)至少大2倍。此外，與以 DNA 為基礎(chǔ)的生物相比，RNA 病毒通常被認(rèn)為其遺傳物質(zhì)復(fù)制的準(zhǔn)確性較低，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈π图m正機(jī)制[23]。為了確保長度約 30 kb 的 RNA 鏈被正常合成，冠狀病毒已經(jīng)進(jìn)化出一種特殊的 RNA 合成機(jī)制，它能夠在缺少外源 RNA 引物的情況下啟動 RNA 從頭合成(de novo)，這在所有 RNA 病毒中是獨(dú)一無二的。此 RNA 合成過程受到嚴(yán)格調(diào)控，以最大限度地減少被宿主細(xì)胞防御攻擊。其中 nsp7 和nsp8 作為 nsp12 的輔助因子激活并促進(jìn)病毒 RNA 的合成，并與雙功能核糖核酸外切酶/RNA帽(鳥嘌呤N-7)甲基轉(zhuǎn)移酶[ RNA cap (guanine N-7) methyltransferase ] nsp14 結(jié)合形成 nsp12/nsp7/nsp8/nsp14 復(fù)合體。這個復(fù)合體將 RNA 聚合、校對和帽子修飾活動整合到一個多功能聚合蛋白中。這個大分子聚合物可能與解旋酶/RNA 三磷酸酶(helicase/RNA triphosphatase)nsp13 和 2′O-MTase[2′O-methyltransferase(甲基轉(zhuǎn)移酶)] nsp16 結(jié)合，構(gòu)成冠狀病毒復(fù)制/轉(zhuǎn)錄機(jī)制的核心，它能夠參與協(xié)調(diào)的 RNA 合成和處理活動[15, 24-26]。通過多個 nsp 蛋白的聯(lián)合作用，保證了冠狀病毒近 30 kb 的全長基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制。

三、靶向 RdRp 的藥物

冠狀病毒的復(fù)制周期由侵入、復(fù)制、組裝與分泌四個階段構(gòu)成[27]。首先冠狀病毒通過內(nèi)吞體途徑或細(xì)胞表面非內(nèi)吞體途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞。在此之前，病毒的 S 刺突蛋白誘導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜的融合[28]。然后，病毒在宿主細(xì)胞質(zhì)中利用宿主細(xì)胞器及原料，以病毒的正義單鏈 RNA 作為 mRNA 翻譯生成 RdRp。病毒 RdRp 起始轉(zhuǎn)錄完整負(fù)義鏈，生成 mRNA，其亞基因組是嵌套轉(zhuǎn)錄模式，具有相同的 5′端不譯區(qū)和 3′端的 poly-A 尾。病毒 RdRp 與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(transcriptional regulatory sequences, TRS)作用，使得 5′前導(dǎo)序列與每個基因的起始序列連接，完成亞基因組 mRNA 合成，然后翻譯形成其他結(jié)構(gòu)蛋白。最后，核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)和基因組 RNA 組裝形成螺旋形核衣殼，并與其他的結(jié)構(gòu)蛋白共同裝配成病毒顆粒，經(jīng)胞吐分泌到細(xì)胞外。理論上，阻斷病毒復(fù)制周期的任何一個環(huán)節(jié)都可以抑制病毒復(fù)制[29]。

高特異性抗病毒靶向藥物的發(fā)現(xiàn)與研制尤為重要。因?yàn)?RdRp 在病毒中高保守，其抑制劑可作為抗 RNA 病毒的廣譜抗病毒藥物。在 RdRp 蛋白結(jié)構(gòu)中有一個巨大的凹槽結(jié)構(gòu)區(qū)作為合成病毒 RNA 的活性中心[16]。SARS-CoV-2 與 SARS-CoV 的 RdRp 蛋白序列相似性高達(dá) 96%，而且已有突變位點(diǎn)都不在活性中心。因此，針對 SARS-CoV 病毒 RdRp 的抑制劑有可能治療SARS-CoV-2感染[17]。

首先是現(xiàn)有藥品中的法匹拉韋(favipiravir)。法匹拉韋是一種吡嗪類似物，屬于 RdRp 抑制劑，由于其對不同 RNA 病毒的抗病毒活性和高耐藥性屏障，具有廣譜抗病毒活性[30]。法匹拉韋起初用于治療新型和復(fù)發(fā)型流感。法匹拉韋對狂犬病毒、埃博拉病毒等多種RNA病毒均具有較好的抑制作用。法匹拉韋主要是作為前體藥物(prodrug)，在真核生物磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為呋喃糖基5′-三磷酸代謝產(chǎn)物(ribofuranosyl 5′-triphosphate, RTP)[31]。Favipiravir-RTP可作為NTP替代物參與病毒RNA鏈的合成，并抑制甲型流感病毒RdRp的活性。其廣譜抗RNA病毒活性可能是Favipiravir-RTP摻入正在延伸的病毒RNA鏈中，通過模糊的堿基配對或鏈終止導(dǎo)致致死性突變，或者與三磷酸腺苷(ATP)和鳥苷三磷酸(GTP)競爭性結(jié)合保守的聚合酶結(jié)構(gòu)域而阻止病毒RNA的復(fù)制[30]。

利巴韋林(ribavirin)是一種具有廣譜抗病毒活性的尿苷類似物(1-β-D-呋喃呋喃糖基-1,2,4-三唑基-3-羧酰胺, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)，臨床上多用于拉沙熱、嚴(yán)重呼吸道合胞病毒感染和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治療。利巴韋林屬于尿苷類似物，可競爭性抑制病毒的三磷酸尿苷合成，使RNA復(fù)制因缺少原料而中斷，從而抑制病毒在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散。利巴韋林也能被整合到病毒基因組中，導(dǎo)致錯配，增加不能存活的病毒顆粒的產(chǎn)生，并能抑制細(xì)胞內(nèi)的肌苷單磷酸脫氫酶 (inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)活性來耗盡細(xì)胞內(nèi)的GTP，從而達(dá)到抗病毒作用[32]。

瑞德西韋(remdesivir, GS-5734)是核苷類抗病毒藥品，是一種新型的L-丙氨酸2-乙基丁酯氨基磷酸酯(2-ethylbutyl L-alaninate phosphoramidate)前體藥品，體外可有效抑制冠狀病毒，其在細(xì)胞內(nèi)三磷酸化后會與ATP競爭抑制 RdRp 的活性。在多種細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變成NTP活性形式，它結(jié)合到新生病毒 RNA 鏈中，導(dǎo)致復(fù)制鏈早熟終止，最終抑制病毒核酸的合成。瑞德西韋最初用于埃博拉(Ebola)病毒感染，在培養(yǎng)細(xì)胞、小鼠和非人靈長類動物(nonhuman primate，NHP)模型中對 MERS-CoV、SARS-CoV 以及尼帕病毒(Nipah virus)等多種 RNA 病毒均具有抑制活性, 是一種很有前景的抗病毒藥品[17, 33]。

有些抗病毒藥品雖然不是靶向 RdRp，但可以間接干擾 RdRp 的功能，從而阻止病毒復(fù)制，如洛匹那韋/利托那韋(lopinavir/ritonavir)、干擾素等。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA) 2000 年批準(zhǔn)洛匹那韋/利托那韋用于治療艾滋病。洛匹那韋/利托那韋的主要有效成分洛匹那韋可抑制病毒的蛋白酶，使病毒復(fù)制后期的多聚蛋白不能順利裂解，產(chǎn)生未成熟、感染能力減弱的病毒。冠狀病毒的復(fù)制也需要病毒蛋白酶的作用，洛匹那韋/利托那韋可能會與冠狀病毒蛋白酶結(jié)合從而抑制其正常功能[3-5]。中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》試行第五版中說明洛匹那韋/利托那韋可試用于臨床新型冠狀病毒的抗病毒治療[6]。

干擾素可以促進(jìn)人體抗病毒蛋白的生成，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。體外，干擾素可抑制冠狀病毒的復(fù)制，其中β干擾素的抑制能力最強(qiáng)。臨床上，干擾素與利巴韋林聯(lián)合使用可顯著抑制冠狀病毒的復(fù)制[34]。

四、結(jié)論

COVID-19疫情出現(xiàn)以后，已有多個藥物進(jìn)入治療 COVID-19 的臨床研究。病毒 RdRp 相對其他病毒蛋白保守性較高，與 SARS-CoV RdRp 的氨基酸序列相似性高達(dá) 96%，提示可能是一個重要候選靶標(biāo)。SARS-CoV-2 的 RdRp 結(jié)構(gòu)功能及其抑制劑的深入分析有助于研發(fā)新藥物。