趙 林，向 瑜，賴曉霏，周發(fā)春△

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.檢驗科，重慶 400016

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于有包膜的β屬冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒基因的同源性達到85%以上[1-2]，但是否來源于蝙蝠尚存爭議[3]。目前該病毒主要通過呼吸道飛沫傳播[4]。感染者早期有發(fā)熱、乏力、干咳，嚴重者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能障礙綜合征，甚至死亡[5-8]；尸檢結(jié)果提示，肺部病變及肺泡細胞損傷與透明膜形成有關(guān)[9]。目前將新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施進行管理。因此，為有效地控制疫情傳播，需要進一步提高核酸檢測的陽性率，避免漏診。本文從臨床檢驗的角度分析疫情下面對的挑戰(zhàn)和應(yīng)實施的對策。

1 COVID-19患者的常規(guī)檢測結(jié)果

COVID-19患者的常規(guī)檢查結(jié)果主要表現(xiàn)為早期白細胞總數(shù)正?；蚪档?，淋巴細胞計數(shù)減少[2,4,10-13]，外周血淋巴細胞中B細胞數(shù)明顯下降，CD4+及CD8+T細胞水平不斷下降[4,10-13]。部分患者伴有C反應(yīng)蛋白和紅細胞沉降率的升高，降鈣素原正常，重型、危重型患者常伴有白細胞介素-6(IL-6)的升高；大多數(shù)患者出現(xiàn)D-二聚體升高，以及出現(xiàn)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)異常[10]。這些指標雖然沒有診斷特異性，但是如何從這些常規(guī)結(jié)果中篩選出可有效預(yù)測患者重癥傾向的指標也具有重要意義。

2 SARS-CoV-2的特異性檢測

SARS-CoV-2感染人體后，在呼吸道上皮細胞內(nèi)大量繁殖，因此，目前COVID-19患者的確診仍然依靠病毒核酸的檢測。但核酸檢測易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，若患者在檢測后出現(xiàn)假陰性結(jié)果，會導(dǎo)致隔離不及時，可能造成疾病的傳播，因此，準確的診斷對于疫情的防控和患者的治療具有重要的意義[14]。目前SARS-CoV-2常用的檢測方法包括：(1)實時熒光定量PCR(RT-PCR)；(2)病毒基因二代測序技術(shù)；(3)COVID-19病毒的抗體檢測。以下就這3種檢測方法的優(yōu)缺點進行逐一介紹。

2.1SARS-CoV-2的RT-PCR檢測 采用RT-PCR檢測SARS-CoV-2的核酸結(jié)果為陰性時不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括標本的采集部位及標本質(zhì)量，標本采集的時間與病毒載量，標本的保存、運輸和處理，試劑盒本身的局限性，以及其他原因[15]。

2.1.1標本的采集部位及標本質(zhì)量 目前臨床主要采集上呼吸道標本進行SARS-CoV-2核酸檢測，要求患者和采樣人員相互配合，若采集鼻咽拭子、口咽拭子深度不夠，易導(dǎo)致采集到的標本中病毒載量較低，檢測結(jié)果就出現(xiàn)假陰性。下呼吸道標本(深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液等)比上呼吸道標本(鼻咽拭子、口咽拭子等)更易檢出病毒，尸檢結(jié)果也證實該結(jié)論[9]。然而COVID-19患者多表現(xiàn)為干咳，深部痰液標本難以獲取。肺泡灌洗液和支氣管灌洗液等標本采集難度大，采樣人員感染風(fēng)險大，通常對實施氣管插管的患者和重癥患者優(yōu)先采集下呼吸道標本。但是采集下呼吸道標本的患者所占比例小，對大多數(shù)患者仍采集易于獲取的上呼吸道標本，因此易導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2.1.2標本采集時間與病毒載量 COVID-19的潛伏期為1～14 d，多為3～7 d[11]，絕大多數(shù)患者就診時可能已經(jīng)遷延了數(shù)天至數(shù)周，咽拭子檢測時是否為最佳時期，標本內(nèi)病毒載量是否仍然在商品化核酸檢測試劑盒的檢測范圍內(nèi)還有待確定。若咽拭子中的病毒載量小，低于試劑盒的最低檢測限，易導(dǎo)致核酸結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。根據(jù)以往研究經(jīng)驗，標本的病毒載量從高到低依次為下呼吸道標本、上呼吸道標本、血液標本和糞便標本。但COVID-19患者隨著機體免疫系統(tǒng)的變化，體內(nèi)病毒載量也隨著病程的不斷變化而發(fā)生著動態(tài)變化。

2.1.3標本的保存、運輸和處理 RNA病毒標本的保存、運輸和處理對于核酸檢測至關(guān)重要。SARS-CoV-2是一種RNA病毒，體外較易發(fā)生降解，因此，對保存、運輸和處理的要求很高?！缎滦凸跔畈《痉窝追揽胤桨?第五版)》規(guī)定用于病毒分離和核酸檢測的標本應(yīng)盡快進行檢測，能在24 h內(nèi)檢測的標本可置于4 ℃保存；24 h內(nèi)無法檢測的標本則應(yīng)置于-70 ℃或以下保存(如無-70 ℃保存條件，則于-20 ℃冰箱暫存)，標本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融[13]。COVID-19流行前期，本市的患者均在所在醫(yī)院采集標本，然后由醫(yī)院的工作人員將標本送至區(qū)級或市級疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)一檢測。從采樣到運輸至疾病預(yù)防控制中心的時效性以及標本保存和低溫運輸過程是否達標，對于SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果準確性也至關(guān)重要。

2.1.4試劑盒本身的局限性 為積極應(yīng)對COVID-19的嚴重疫情，試劑生產(chǎn)商試劑盒研發(fā)時間短，可能存在對試劑優(yōu)化不充分以及試劑批次間存在較大差異的情況。目前不同廠家的商品化的試劑盒一般只檢測1～2個部位的標本，只做一次擴增反應(yīng)，缺乏標本間、標本內(nèi)的重復(fù)也可能是造成假陰性結(jié)果的原因。所以盡可能采集同一患者不同部位的標本(上呼吸道、下呼吸道、血液、糞便標本)，并用不同廠家的商品化的試劑盒進行平行檢測，可最大限度地避免核酸檢測假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2.1.5其他原因 SARS-CoV-2待測靶序列的變異或其他原因?qū)е鲁霈F(xiàn)的序列改變可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。試劑或擴增反應(yīng)中存在未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子也可能會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

2.2病毒基因二代測序技術(shù) 利用病毒基因二代測序技術(shù)檢測SARS-CoV-2在《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第一版)》中已被列為確定診斷的標準，符合病例的定義，即采集痰液、咽拭子等呼吸道標本進行病毒全基因組測序，與已知的SARS-CoV-2高度同源[2]。病毒基因測序雖然準確性高，但是耗時長、成本高，不能廣泛應(yīng)用于疫情流行期大量標本的檢測。在目前已經(jīng)具有商品化試劑盒的情況下，疫情暴發(fā)后大量標本需要檢測，病毒基因測序技術(shù)非首選的診斷方案，但可以用于疑難病例的診斷與鑒別診斷。

2.3SARS-CoV-2的抗體檢測 由于RT-PCR檢測SARS-CoV-2具有假陰性率較高的缺點，病毒基因二代測序的費用高、耗時長，如能夠在不同時期對患者體內(nèi)抗體進行檢測可以有效緩解診斷該病時面臨的困境。目前已經(jīng)有重慶、浙江等地的科研機構(gòu)成功研發(fā)出針對SARS-CoV-2檢測的免疫球蛋白(Ig)M、IgG試劑盒，主要方法包括化學(xué)發(fā)光法和膠體金法兩種?；瘜W(xué)發(fā)光法靈敏度高，易檢測出低水平抗體，假陽性率偏高；膠體金法的Cut-Off值較高，檢測靈敏度較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。最好采用兩種方法進行檢測，互為補充。由于抗體檢測是血清學(xué)的檢測，患有肝臟疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病的患者會發(fā)生非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)部分假陽性結(jié)果。目前，抗體檢測已經(jīng)應(yīng)用于臨床，主要針對疑似病例和無癥狀感染者的血清學(xué)檢查，作為核酸檢測的重要補充?？傊?，針對抗體檢測的試劑盒具有快速、高通量和低成本的特點，可用于COVID-19的早期診斷、流行病學(xué)篩查和臨床轉(zhuǎn)歸的預(yù)測。

3 COVID-19流行時期臨床檢驗面臨的挑戰(zhàn)與對策

為了避免含有病毒的標本在采集、運送、檢測以及后續(xù)處理的環(huán)節(jié)中傳播疾病，檢驗人員也必須采取相應(yīng)的防護措施。其中氣溶膠傳播也是可能傳播途徑之一，而標本在運輸、操作和處置過程中均可產(chǎn)生氣溶膠[16-17]，防護措施也要包含避免通過氣溶膠感染的措施[4]。中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會制定了《新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南(試行第一版)》，明確說明指導(dǎo)臨床檢驗時需進行有效的生物安全防護[18]。

3.1標本的采集和運輸中的防護要求 采集標本由臨床醫(yī)生操作完成，要求進行三級生物安全防護，不建議檢驗人員進入隔離區(qū)采集標本。標本采集后要求置于兩層一次性密封袋內(nèi)密封。采集后的抽血針、棉簽等，需放入相應(yīng)的醫(yī)療銳器盒或廢物箱[19]。標本院內(nèi)運輸由專人運送入實驗室，確認裝箱前有消毒環(huán)節(jié)，參與運輸?shù)娜藛T應(yīng)嚴格做好防護；院外送檢的標本，需嚴格按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》要求執(zhí)行[20]。

3.2標本的前處理、檢驗過程中的防護 實驗室接收和處理標本，應(yīng)進行三級生物安全防護，操作人員應(yīng)穿戴防護服、口罩、防護鏡等。手工檢測的項目要求在生物安全柜中進行。標本開箱或開袋盡可能在生物安全柜里完成檢驗操作，血液標本在離心前避免試管破損或者泄漏等。拔試管帽時防止標本飛濺，消毒后再上機離心，防止氣溶膠的形成。實驗室環(huán)境應(yīng)符合二級或三級生物安全實驗室規(guī)范。RT-PCR的操作人員應(yīng)該具有資質(zhì)，操作的環(huán)境應(yīng)符合要求，開展前應(yīng)由省級衛(wèi)生行政部門審核后報國家衛(wèi)生健康委員會批準[18]。

3.3檢測后的防護 操作完成以后，要按照操作規(guī)定完成防護設(shè)備的脫卸。檢驗后的標本應(yīng)確保密封嚴密；盛裝標本的試管，在生物安全柜中重新加蓋新的塞子，然后密封在袋子中，避免在移動過程產(chǎn)生氣溶膠。操作根據(jù)情況盡量集中時間統(tǒng)一操作，操作完成后的實驗室應(yīng)按照要求采用紫外線燈照射、75%乙醇溶液或有效氯的消毒液噴霧全面消毒。廢棄物可以參照《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》進行處理[19]。

3.4特殊情況的處理 檢測標本在操作時發(fā)生飛濺、試管破損等造成小范圍的污染時，使用含有效氯消毒液進行消毒至少30 min。若造成實驗室污染時，應(yīng)保持實驗室空間密閉，避免污染物擴散。使用含有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區(qū)域，消毒至少30 min。當(dāng)大量的污染物溢灑時，應(yīng)采用過氧乙酸加熱熏蒸實驗室[18-19]。

4 總 結(jié)

臨床檢驗在做好患者的常規(guī)檢查外，加強與臨床一線醫(yī)生共同分析探討重癥患者預(yù)后相關(guān)的指標具有重要的意義。其次，重視在核酸檢測時造成假陰性結(jié)果的多種因素，提高檢測效率的同時與相關(guān)機構(gòu)合作研發(fā)出靈敏度和特異度高的檢測方法也是遏制疫情的有效措施。最后，針對檢驗中可能存在的暴露因素，按照實驗室生物安全的規(guī)章制度做到有效的防護，降低檢驗人員的感染風(fēng)險也至關(guān)重要。