張曉敏，王培昌，劉 靜

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放功能障礙與各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，突觸的數(shù)量改變也與許多腦部疾病有關(guān)[1-2]，如阿爾茨海默病、癲癇等疾病[3-4]。突觸囊泡蛋白2A(SV2A)是一種膜蛋白，特異性表達(dá)于突觸囊泡中，主要調(diào)節(jié)腦內(nèi)動(dòng)作電位依賴(lài)性神經(jīng)遞質(zhì)釋放。研究發(fā)現(xiàn)，SV2A與癲癇的發(fā)病機(jī)制及治療存在密切聯(lián)系，SV2A基因敲除小鼠出生后不久即表現(xiàn)出嚴(yán)重的癲癇發(fā)作[5]。據(jù)報(bào)道，不同類(lèi)型的癲癇動(dòng)物和癲癇患者腦內(nèi)SV2A蛋白表達(dá)水平均有不同程度的改變，以SV2A為治療靶點(diǎn)的抗癲癇藥物左乙拉西坦及其類(lèi)似物目前已被廣泛應(yīng)用于臨床[6-8]。然而SV2A調(diào)控癲癇的作用機(jī)制仍未可知，為了進(jìn)一步研究SV2A基因在癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的功能，本文構(gòu)建了鼠SV2A基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)與鑒定，旨在為進(jìn)一步研究SV2A在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的機(jī)制及作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 真核表達(dá)載體p3×Flag-CMV-10和HEK293T細(xì)胞均為中科院生物物理研究所惠贈(zèng)；菌株Top10感受態(tài)細(xì)胞、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、T4 DNA連接酶、500 bp DNA ladder和D15000+2000 DNA ladder購(gòu)自中國(guó)北京Tiangen公司；HindⅢ、EcoRⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、CutSmart購(gòu)自美國(guó)NEB公司；5×All-In-One RT Master Mix購(gòu)自加拿大Abm公司；Trizol、Lipo3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白水平測(cè)定試劑盒、5×Tris-甘氨酸蛋白電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液、5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自中國(guó)北京Solarbio公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；抗Flag抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗β-actin抗體及對(duì)應(yīng)二抗購(gòu)自中國(guó)北京中杉金橋公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；曝光儀購(gòu)自中國(guó)上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1獲得cDNA 用Trizol法提取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織RNA[9]，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：以RNA為模板，加入5×All-In-One RT Master Mix。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min；冷卻至4 ℃，即獲得模板cDNA。

1.2.2獲得目的基因 依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鼠SV2A(基因ID:64051)基因mRNA的序列(NM_022030.3)，設(shè)計(jì)巢式PCR引物，應(yīng)用Primer-Blast設(shè)計(jì)第1對(duì)引物，引物序列為F1:5′-TCC AGG CCC TAG TTC CTC TC-3′，R1:5′-TGT GCC TGC CAT CCC TAA AG-3′。根據(jù)基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)第2對(duì)引物，分別在上下游引物中加入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，并加入相應(yīng)的保護(hù)堿基，引物序列為：F2:5′-CCC AAG CTT ATG GAA GAA GGC TTT CGA GAC -3′，R2:5′-GGA ATT CTC ACT GCA GCA CCT GTC C-3′。引物由中國(guó)生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以cDNA為模板，分別以F1、R1和F2、R2為引物，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；冷卻至4 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離并在紫外燈下切膠回收目的條帶，回收、純化擴(kuò)增產(chǎn)物采用Tiangen的DNA回收試劑盒。

1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別對(duì)載體p3XFlag-CMV-10和SV2A的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系50 μL。酶切載體時(shí)：載體10 μL，10×Cut Smart 5 μL，兩種內(nèi)切酶各1 μL，體系用ddH2O補(bǔ)齊。酶切目的基因時(shí)：DNA產(chǎn)物43 μL，10×Cut Smart 5 μL，兩種內(nèi)切酶各1 μL。目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物37 ℃孵育2 h，載體孵育時(shí)間延長(zhǎng)至4～6 h。將全部酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，并對(duì)目的條帶切割回收。將回收的目的基因與載體以3∶1的比例混合，加入T4 DNA連接酶和T4 DNA Buffer，室溫連接1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Top10中，37 ℃ 200 r/min搖菌45 min，將轉(zhuǎn)化后的菌液接種于加有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。挑取多個(gè)單克隆菌落，分別置于10 mL加入氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖菌12～14 h，用Tiangen質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.4重組質(zhì)粒的鑒定 用HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，對(duì)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)酶切片段大小鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。同時(shí)對(duì)雙酶切鑒定構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒送中國(guó)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的SV2A的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5重組質(zhì)粒的表達(dá) 在六孔板中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)，置于37 ℃，CO2水平為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度達(dá)到70%～90%時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染試劑A：125 μL DMEM培養(yǎng)基與5 μL Lipofectamine 3000混合孵育10 min。配制轉(zhuǎn)染試劑B：125 μL DMEM培養(yǎng)基中加入5 μL P3000和2.5 μg p3×Flag-CMV-10-SV2A質(zhì)?；蚩蛰d體質(zhì)粒(作為空白對(duì)照)。將試劑A與試劑B混合后在室溫下孵育10 min，再加入六孔板的培養(yǎng)基中混勻繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后換成新鮮配制的完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至48 h時(shí)收集細(xì)胞，加入1%Triton×100裂解蛋白。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)鑒定 將提取的總蛋白用BCA法測(cè)定蛋白水平[10]，各取40 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(350 mA，2 h)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后裁膜，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，然后用5%的脫脂奶粉持續(xù)封閉2 h，加入特異性的Flag抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；用TBST緩沖液洗膜，每次5 min，共3次；加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。加入電化學(xué)發(fā)光液后曝光。以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1SV2A全序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳鑒定 SV2A基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)分析，對(duì)照DNA Marker，在2 239 bp左右可見(jiàn)1條清晰條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，見(jiàn)圖1。

注：M表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)帶；1表示SV2A基因擴(kuò)增條帶；2表示空白對(duì)照。

圖1SV2A基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鑒定及測(cè)序 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-10-SV2A經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ酶切后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠電泳成像系統(tǒng)分析，可見(jiàn)位于2 239 bp處的SV2A目的基因片段和6 200 bp左右處的p3×Flag-CMV-10載體片段，說(shuō)明SV2A基因已成功插入p3×Flag-CMV-10載體中，且陽(yáng)性菌落測(cè)序后與GenBank檢索的SV2A的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證明SV2A正確插入p3×Flag-CMV-10載體，見(jiàn)圖2、3。

注：M表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)帶；1表示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒條帶；2表示空白對(duì)照。

圖2p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鑒定

圖3 SV2A測(cè)序結(jié)果

2.3Western blot分析SV2A蛋白在HEK293T細(xì)胞的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，裂解后提取蛋白，Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染p3×Flag-CMV-10-SV2A質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞在82×103左右處可見(jiàn)1條明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，轉(zhuǎn)染空載體p3×Flag-CMV-10的HEK293T細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)SV2A蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖4。

注：M表示DNA標(biāo)準(zhǔn)帶；1表示重組質(zhì)粒擴(kuò)增條帶；2表示轉(zhuǎn)染空載體條帶；3表示空白對(duì)照。

圖4SV2A在HEK293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

3 討 論

SV2A是突觸囊泡蛋白2的家族成員之一，該蛋白家族還包括SV2B和SV2C，這3種同源基因均表達(dá)于神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞的囊泡中。其中SV2A是分布最廣泛的一種亞型，主要分布于腦組織中，包括大腦皮層、海馬和小腦等部位。它能夠調(diào)節(jié)動(dòng)作電位依賴(lài)的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，維持突觸囊泡穩(wěn)態(tài)，并參與內(nèi)分泌囊泡的胞吐作用[11-12]。人類(lèi)SV2A基因位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的2區(qū)1帶(1q21.2)，包含14 565個(gè)堿基對(duì)，編碼了一段有13個(gè)外顯子的約4 353個(gè)堿基對(duì)的mRNA，翻譯成相對(duì)分子質(zhì)量約為82.6×103的蛋白，共包含742個(gè)氨基酸[13]。SV2A有一段長(zhǎng)而保守的N-末端序列，其中前57個(gè)氨基酸是與突觸結(jié)合蛋白-1(SYT-1)C2B結(jié)構(gòu)域相互作用的部位，SYT-1是一種Ca2+感受器，二者結(jié)合可以調(diào)節(jié)突觸的胞吐作用。SV2A共有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中第6、7跨膜結(jié)構(gòu)域之間有1個(gè)凸向胞質(zhì)內(nèi)的大環(huán)結(jié)構(gòu)，第7、8跨膜結(jié)構(gòu)域之間有1個(gè)凸向囊泡腔內(nèi)的大環(huán)結(jié)構(gòu)，后者有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這3個(gè)位點(diǎn)對(duì)于神經(jīng)肉毒素BoNT/A和BoNT/E進(jìn)入神經(jīng)元至關(guān)重要[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中利用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，巢式PCR需要設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過(guò)第1對(duì)引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物比目的DNA片段長(zhǎng)，第2對(duì)引物又稱(chēng)巢式引物，因其擴(kuò)增的目的片段位于第1對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部而得名，非目的片段與兩套引物同時(shí)結(jié)合的可能性很小，因此通過(guò)該引物可特異性的擴(kuò)增出位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部的DNA片段。質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中載體的選擇至關(guān)重要，p3×Flag-CMV-10是一種常用的帶有3×Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體，它具有許多優(yōu)勢(shì)可保證基因穩(wěn)定高效的表達(dá)，普通的Flag標(biāo)簽含8個(gè)氨基酸殘基，而3×Flag標(biāo)簽含22個(gè)氨基酸殘基，位于融合蛋白的外表面，具有很高的免疫靈敏度，便于檢測(cè)和純化目的蛋白；功能強(qiáng)大的CMV啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)目的蛋白高水平表達(dá)；多克隆位點(diǎn)便于目的基因插入；具有多種限制性酶切位點(diǎn)可供選擇；內(nèi)有Neo抗性標(biāo)記，可用G418篩選成功轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞；既可用于瞬轉(zhuǎn)也可用于穩(wěn)轉(zhuǎn)。上述獨(dú)特的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)可保證目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定高效表達(dá)且便于檢測(cè)。HEK293T細(xì)胞來(lái)源于人胚胎腎上皮細(xì)胞，是一種常用的研究外源基因表達(dá)的細(xì)胞株，細(xì)胞增殖速度快，貼壁生長(zhǎng)，但其貼壁強(qiáng)度較低，因此換液時(shí)應(yīng)格外小心。易于轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)的特性使其成為一種強(qiáng)大的研究基因功能的工具細(xì)胞而被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)也選用了HEK293T細(xì)胞作為驗(yàn)證基因表達(dá)效果的細(xì)胞，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染效果理想，重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-10-SV2A成功轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，且目的蛋白得到穩(wěn)定正確表達(dá)。本結(jié)果為進(jìn)一步研究SV2A在癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆的方法成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-CMV-10-SV2A，通過(guò)菌落PCR、酶切和測(cè)序檢測(cè)了質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，并在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證了其表達(dá)情況。p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為今后建立穩(wěn)定表達(dá)SV2A的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究SV2A的生物學(xué)功能及其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。