許曉燕綜述，夏 嬙審校

0 引 言

免疫系統(tǒng)在機體識別和清除外來病原微生物中發(fā)揮重要作用，分為固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)。由于昆蟲在長期生物進化中所形成的地位，使其免疫系統(tǒng)與脊椎動物的免疫系統(tǒng)不同，只有固有免疫系統(tǒng)，細菌、病毒或藥物等刺激會啟動昆蟲的免疫系統(tǒng)。昆蟲體內因不同刺激而產生的免疫物質稱為抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)[1]。昆蟲抗菌肽作用廣泛，尤其免疫調控方面的研究備受關注[2]。

1 昆蟲抗菌肽概述

在抗菌肽研究中，昆蟲抗菌肽的研究起步最早，科學家們最先發(fā)現的抗菌肽是從鱗翅目昆蟲惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)中發(fā)現的，命名為天蠶素[3]。目前在抗菌肽數據庫(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中可以查到的昆蟲抗菌肽約有310種。根據抗菌肽的結構和功能的差異，昆蟲抗菌肽大致可分為3類，分別為天蠶素類、防御素類及富含脯氨酸或甘氨酸類。①天蠶素類(cecropia)昆蟲抗菌肽：因最初從惜古比天蠶體內獲得而得名，目前天蠶素類抗菌肽多從鱗翅目和雙翅目昆蟲體內提取，已知的主要天蠶素類抗菌肽有天蠶素A、天蠶素B和天蠶素D，主要由35～37個不含半胱氨酸的氨基酸殘基組成[4-6]，對革蘭陽性(G+)菌和革蘭陰性(G-)菌均有抑制作用[7-8]；②防御素類(Defensins)昆蟲抗菌肽：此類抗菌肽不是昆蟲獨有的抗菌肽，但是在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目等昆蟲體內均提取到了不同類型的防御素[9]，主要由氨基酸和半胱氨酸殘基組成[10]，昆蟲防御素對G+菌和G-菌均有作用，尤其對金黃色葡萄球菌等G+菌抑制作用更為明顯[11-12]；③富含脯氨酸或甘氨酸類昆蟲抗菌肽：富含脯氨酸的抗菌肽因結構中含有豐富的脯氨酸而得名，主要有凝集素(Lebocins)、果蠅菌素(Drosocin)和Metchnikowin等抗菌肽[13]。富含甘氨酸的抗菌肽主要有攻擊素(Attacins)、雙翅菌肽(Diptericins)等抗菌肽。此類抗菌肽能夠抑制大多數G-菌以及有選擇性的抑制某些G+菌的繁殖[14-16]。

昆蟲抗菌肽具有抑制細菌繁殖、抗病毒、抗真菌及抗寄生蟲等多種作用[17-18]。昆蟲抗菌肽不僅具有抗微生物活性，還具有抗腫瘤活性，如克隆自美國白蛾的抗菌肽ABP-dHC-Cecropin A及其類似物能有效殺傷白血病細胞[19]，蜜蜂的蜂毒肽對胃癌細胞具有較強的細胞毒性[20]，家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用于人肝癌HepG2細胞后會導致HepG2細胞核變形，線粒體膜電位降低[21]，來自果蠅的抗菌肽可以與腫瘤壞死因子聯合作用殺死荷瘤果蠅幼蟲體內的腫瘤細胞[22]。除此之外，昆蟲抗菌肽還具有免疫佐劑作用，陳立青[23]研究證實，家蠅幼蟲抗菌肽可作為免疫佐劑提高卵白蛋白(OVA)免疫小鼠體內IgG抗體效價、促進脾細胞增殖以及提高NK細胞的殺傷能力。近年來隨著對抗菌肽的深入研究發(fā)現昆蟲抗菌肽在免疫調控中作用越來越重大[2,24]。

2 昆蟲抗菌肽的免疫調節(jié)作用

從鱗翅目、雙翅目、膜翅目及鞘翅目昆蟲體內提取的抗菌物質均具有良好的免疫調節(jié)作用，如激活免疫細胞、誘導細胞因子產生等[25]。

2.1鱗翅目昆蟲的免疫調節(jié)作用鱗翅目昆蟲主要包括蛾類和蝶類等昆蟲，對此目昆蟲抗菌肽的研究主要集中在蛾類昆蟲。Wang等[26]在柞蠶蛾(Antheraeapernyi)體內提取到了天蠶素B，將天蠶素B的鉸鏈區(qū)切除而獲得一種新型的抗菌肽-天蠶素DH。10 mmol濃度下抗菌肽-天蠶素DH能夠有效抑制RAW264.7細胞中一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6的表達，尤其對NO的抑制率達到了85%。天蠶素A亦可以有效抑制NO的產生，且具有一定的濃度依賴性。當天蠶素A的濃度達到5μmol時，可以完全抑制NO的產生，濃度達到25 μmol，不僅能夠抑制NO的產生，還能夠顯著抑制炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和小鼠巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)- 2 抗體mRNA的表達，從而發(fā)揮抗菌肽的抗炎作用[27]。將家蠶體內富含甘氨酸的抗菌肽(Bombyx mori gloverin A2，BMGlvA2)作用于炎癥小鼠后可以有效減少小鼠脾的損傷、壞死以及脾臟內淋巴細胞和巨噬細胞的數量，同時高劑量的BMGlvA2(8.0mg/kg)還可以顯著降低炎癥小鼠體內的炎性細胞因子 IL-1β、IL-6和 TNF-α的表達，從而減輕小鼠的炎癥反應[28]。

2.2雙翅目昆蟲的免疫調節(jié)作用雙翅目昆蟲抗菌肽免疫調節(jié)的研究主要集中在蠅類、虻類、蚊類等昆蟲，其中對家蠅的研究最為廣泛。在金黃色葡萄球菌刺激下，轉導重組家蠅抗菌肽A2(Mdc-A2)慢病毒表達載體的RAW264.7細胞株(RAW-Mdc-A2)與未轉導Mdc-A2的RAW264.7細胞株相比，其TNF-α轉錄變異體1、2(TNF-α-tv-1、TNF-α-tv-2)的mRNA表達以及TNF-α的含量均顯著降低，同時還能下調IL-1β mRNA的表達[29]。

從家蠅幼蟲體內提取的抗菌肽MDPF不僅具有促進脾細胞增殖、提高小鼠體內自然殺傷(Natural killer, NK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞活性的作用，還可以提高S180荷瘤小鼠血清中腫瘤抗原特異性免疫球蛋白(Ig)G、IgG2a和IgG2b抗體水平。MDPF對S180荷瘤小鼠脾細胞中干擾素(Interferon, IFN)-γ和Th1轉錄因子T-bet、STAT-4的mRNA表達也有明顯的促進作用[30]；Chen等[31]研究亦發(fā)現，MDPF不僅可以增強由刀豆蛋白A、脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)等刺激的脾細胞增殖和NK細胞的活性，顯著提高由OVA和rL-H5免疫小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的滴度，還能顯著促進免疫小鼠脾細胞產生Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-10)細胞因子。將從馬蠅唾液中提取的天蠶素-TY1(cecropin-TY1)以及從黑蠅唾液腺中提取的抗菌肽SibaCe分別注射到不同小鼠腹腔中，發(fā)現兩種抗菌肽均能夠顯著降低由LPS 誘導小鼠腹腔內巨噬細胞iNOS mRNA的表達以及NO的產生，同時還發(fā)現cecropin-TY1和SibaCec均能夠抑制LPS誘導的細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達，并且具有一定的劑量依賴性[32-33]。

在對埃及伊蚊體內抗菌物質的研究發(fā)現，從埃及伊蚊體內提取的5種抗菌肽(AeaeCec1、2、3、4、5)在濃度為5 μmol時可有效抑制LPS刺激產生的iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。以小鼠為研究模型發(fā)現，AeaeCec1-5能有效降低內毒素休克小鼠模型中小鼠肺臟、血清和腹腔灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達，且作用后小鼠肺損傷和水腫等癥狀與對照組相比均有所減輕。利用AeaeCec1-5治療以大腸桿菌或銅綠假單胞菌感染的小鼠，發(fā)現其可以在一定程度上降低小鼠體內TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，同時還能夠減少肺組織損傷等不良情況的發(fā)生。無論是對內毒素休克小鼠模型的研究還是其他模型的研究，均證實AeaeCec5是AeaeCec1-AeaeCec5中免疫調節(jié)能力最強的抗菌肽[34]。

2.3鞘翅目昆蟲的免疫調節(jié)作用鞘翅目是昆蟲綱中第一大目，對此目昆蟲抗菌肽的研究主要集中在蜣螂以及雙叉犀金龜等昆蟲方面。Lee等[35]從蜣螂體內提取到了一種防御素類抗菌肽-coprisin，25 μmol的coprisin可以使RAW264.7細胞中IL-1β、MIP-1、iNOS mRNA的表達量下降50%以上。Kang等[36]研究coprisin類似物時亦發(fā)現，coprisin類似物可以明顯降低由艱難梭菌(Clostridiumdifficile)引起的急性腸道炎癥小鼠回腸組織提取物中IL-6含量，且小鼠的腸道炎癥也得到有效改善。從蜣螂體內提取的另一種抗菌肽-CopA3，同樣能夠阻斷梭狀芽孢桿菌A誘導的小鼠腸道炎癥，改善由2%葡聚糖硫酸酯鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)誘導的小鼠結腸炎癥狀，降低小鼠回腸中的IL-6和TNF-α含量[37]。除了蜣螂，Lee等[38]從雙叉犀金龜(Allomyrinadichotoma)體內也提取到了一種抗菌肽-Allomyrinasin。Allomyrinasin能夠降低RAW264.7細胞中NO、iNOS以及COX-2的含量，且具有濃度依賴性，200 μg/mL以上的Allomyrinasin可以有效抑制iNOS和COX-2蛋白表達以及降低IL-1β和IL-6含量。

2.4膜翅目昆蟲的免疫調節(jié)作用膜翅目昆蟲僅次于鞘翅目和鱗翅目，是昆蟲目中第三大目，對于本目昆蟲抗菌肽免疫調節(jié)的研究主要為蜂類、蟻類。在研究蜜蜂來源的抗菌肽Apidaecin對人單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的影響時發(fā)現，Apidaecin能夠上調T淋巴細胞共刺激分子CD80的表達，還能夠抑制巨噬細胞主要組織相容性復合物(Major histocompatibility complex, MHC)II類和CD86含量的增加以及抑制巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β等細胞因子；對MIP -1 和巨噬細胞趨化肽(Macrophage chemotactic peptides, MCP)-1的產生亦具有一定的抑制作用[39]。不僅Apidaecin能夠調節(jié)免疫活性，Apidaecin的一種衍生肽Api88亦能夠濃度依賴性的降低促炎細胞因子TNF-α的產生，同時還能夠提高抑炎細胞因子IL-10的含量，降低人單核細胞體內活性氧的產生。此外Api88還能夠促進人肥大細胞脫顆粒，進而調節(jié)其細胞的生物活性[40]。在螞蟻毒液中提取的陽離子抗菌肽P17不僅能夠在體外誘導人單核細胞源性巨噬細胞釋放活性氧和IL-1β，促進炎癥的發(fā)生；還可以刺激小鼠體內巨噬細胞吞噬白色念珠菌以及產生活性氧和IL-1β，進而減輕小鼠胃腸道反應，從而治療白色念珠菌感染小鼠[41]。

3 昆蟲抗菌肽免疫調節(jié)機制

目前研究認為，昆蟲抗菌肽在機體內發(fā)揮免疫調控作用主要通過3條信號通路進行，分別為Toll樣受體信號通路、核轉錄因子-κB信號通路和絲裂原活化蛋白激酶信號通路[42]。當機體被外來病原體感染時，昆蟲抗菌肽可以啟動不同的通路來發(fā)揮其免疫調控作用。

3.1Toll樣受體信號通路模式識別受體(Toll-like receptor, TLR)在抗菌肽的免疫調控中占據重要地位，是免疫調控的啟動者[43]。TLR包括TLR1～TLR10，其中TLR1、TLR2、TLR4～6主要在免疫細胞表面表達，其余的TLR在細胞內表達。外界異物進入機體后，被免疫細胞表面的模式識別受體(TLR2、TLR4等)識別，從而啟動細胞內信號的級聯反應，如位于下游的NF-κB和MAPK信號通路?？咕耐ㄟ^調控相關通路的表達，調節(jié)免疫細胞活性以及TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子的分泌，從而對機體的免疫系統(tǒng)進行調控。如從燕尾蝶(Papilioxuthus)體內分離到的抗菌肽Papiliocin能夠抑制LPS與RAW264.7細胞表面的TLR4結合，從而阻止TNF-α和IL-1β等細胞因子的表達[44]。Wang等[24]研究發(fā)現天蠶素DH和天蠶素B抑制炎性因子的表達，可能是其能與LPS結合，進而阻止或者干擾LPS與TLR4的相互作用，最終抑制了與TLR4相關的下游信號的傳導。從蜣螂體內提取到的Coprisn之所以具有抑炎作用，是因為它能夠抑制LPS與TLR4結合，進而阻止其下游NF-κB的核易位[35]。

3.2NF -κB信號通路研究抗菌肽免疫調節(jié)機制的學者眾多，目前認為核轉錄因子-κB(Nuclear Factor-κB, NF-κB)信號通路是免疫調節(jié)中的重要調控者[45]。在機體免疫應答中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現，從黑蠅唾液中提取的抗菌肽SibaCec能夠影響LPS誘導的炎癥信號通路。LPS (100 ng/mL)能夠誘導NF-κB中 p65亞基從細胞質向細胞核轉移，而SibaCec (10 μg/mL) 對LPS誘導的NF-κB p65亞基移位有明顯的抑制作用，說明SibaCec發(fā)揮其抗炎效果是通過抑制NF-κB炎性信號通路實現的[33]；Wei等[46]亦指出姚虻抗菌肽cecropin-TY1亦可以通過抑制NF-κB信號通路，來減少促炎細胞因子如TNF-α、IL-6的產生。從埃及伊蚊體內提取到的5種抗菌肽(AeaeCec1-5)均具有抑制NF-κB通路中p65磷酸化的作用，尤其是AeaeCec5的抑制率達到了90%以上[32]。Kim等[44]發(fā)現從燕尾蝶(Papilioxuthus)體內分離到的抗菌肽PapiliocinQian能夠抑制NF-κB的表達，Qian等[28]亦發(fā)現高劑量的BMGlvA2 (8.0 mg/kg) 可以降低NF-κB通路的表達水平。

3.3MAPK信號通路抗菌肽發(fā)揮免疫調控作用的另一條重要通路是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，該通路廣泛存在于各種動物細胞的信號轉導途徑中，包括JNK、p38和ERK三大類亞族。在研究黑蠅抗菌肽SibaCec對LPS誘導的炎癥信號通路影響中發(fā)現，SibaCec(10 μg/mL)對LPS誘導的ERK和p38磷酸化具有明顯的抑制作用[31]；經LPS(100 ng/mL)刺激后，小鼠腹腔巨噬細胞中JNK、ERK和p38的磷酸化表達水平顯著增強。從埃及伊蚊體內提取到的五種抗菌肽(AeaeCec1-5)亦可有效抑制MAPK信號通路中JNK、ERK和p38蛋白的激活[34]；從天蠶中分離出來的一種新的抗菌肽CecropinA亦能夠抑制MAPK通路中ERK、JNK和p38三種蛋白的磷酸化，從而抑制COX-2的表達，達到抗炎的目的[27]。

4 展 望

昆蟲是地球上種類最多的生物，其抗菌肽的研究亦備受關注。目前，昆蟲抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗寄生蟲及抗腫瘤等方面研究均取得了重大進展[17-23]。隨著對昆蟲抗菌肽應用的深入研究，發(fā)現其具有多種免疫調控作用。因昆蟲抗菌肽在參與機體免疫調節(jié)時具有作用時間長、不良反應少、生物毒性低等特點，在免疫調節(jié)藥物研發(fā)方面具有良好的應用前景。但是由于昆蟲體內抗菌肽含量少，量產的可行性較低，而通過基因工程、化學合成等方法雖然能實現量產，但是高昂的成本也限制了抗菌肽研發(fā)。隨著各領域對昆蟲抗菌肽研究的深入有望提高其產量，并使其在免疫調控方面的應用取得新的突破。