鄧曉敏 彭佳媛 吳藹林 韓彬 余小平

細(xì)胞自噬(autophagy)是一種對(duì)細(xì)胞生存、分化、發(fā)育和胞內(nèi)代謝平衡都至關(guān)重要的溶酶體降解途徑。其通過(guò)自噬小體和溶酶體以“自我吞噬”的方式回收蛋白質(zhì)和能量，清除受損細(xì)胞器并降解入侵細(xì)菌[1]。細(xì)胞自噬被分為3種類(lèi)型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[2]。其中巨自噬被認(rèn)為是自噬的主要亞型，也是目前研究最廣泛的自噬形式，本文中提到的自噬是指巨自噬。生理水平的自噬可抵御外部刺激的壓力，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但特殊情況下，自噬或自噬相關(guān)蛋白可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死，自噬已被證明可因過(guò)度降解細(xì)胞質(zhì)而導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡[3]。Zhou等[4]研究發(fā)現(xiàn)，自噬對(duì)維持視錐細(xì)胞的功能和長(zhǎng)期生存，支持其代謝需求和抗應(yīng)激能力，在視網(wǎng)膜退行性疾病中具有保護(hù)作用。基礎(chǔ)自噬通過(guò)維持正常細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性而發(fā)揮抑癌作用?？梢坏┠[瘤形成，不平衡的自噬將有助于腫瘤微環(huán)境下癌細(xì)胞存活，并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)育[5]。在乳腺癌化學(xué)治療中，自噬與凋亡相互作用既可產(chǎn)生治療抵抗，也可促進(jìn)癌細(xì)胞死亡[6]。這些現(xiàn)象充分體現(xiàn)了自噬在不同疾病和機(jī)制中的兩面性。本文僅討論了自噬在視網(wǎng)膜光損傷中的兩面性。

1 自噬的特點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路

1.1 自噬的特點(diǎn)自噬是有別于凋亡的另一種細(xì)胞程序性死亡，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育與疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用。自噬在遺傳上具有高度保守的特點(diǎn)，是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生雙膜自噬泡將胞質(zhì)內(nèi)容物傳遞給溶酶體降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程[7]。

自噬基本過(guò)程大致分為3個(gè)階段：(1)自噬前體形成階段：這一階段的自噬誘導(dǎo)主要是通過(guò)由ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，酵母Atg1同系物)、FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD，酵母Atg17同系物)、Atg13 3種蛋白形成的ULK1復(fù)合物與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)之間相互作用實(shí)現(xiàn)的[8]。mTORC1活化抑制細(xì)胞自噬，而mTORC1活性被抑制時(shí)，自噬體逐漸成核并延伸[1]。(2)自噬小體形成階段：自噬小體形成是自噬的中心環(huán)節(jié)。自噬前體在p62(sequesto-some-1)、LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)等蛋白作用下逐漸延長(zhǎng)，識(shí)別并包裹胞漿中所需降解的底物，最終收口成為密閉、球狀自噬小體。在此過(guò)程中p62主導(dǎo)底物識(shí)別，LC3主導(dǎo)雙膜延伸。LC3的脂質(zhì)形式LC3-Ⅱ常被視為自噬活性標(biāo)志，LC3-Ⅱ表達(dá)升高，說(shuō)明自噬體形成或自噬增加[9]。(3)自噬體成熟階段：主要是指自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并在溶酶體酸性蛋白酶作用下降解其內(nèi)容物的過(guò)程。自噬涉及多個(gè)基因和細(xì)胞信號(hào)通路。其細(xì)胞信號(hào)通路并非孤立，而是處于非常復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中。自噬通路與凋亡、氧化應(yīng)激等通路均有交叉，且在一定情況下相互調(diào)節(jié)。

1.2 mTOR通路mTOR(mammalian target of rapamycin)即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以調(diào)控細(xì)胞周期、生長(zhǎng)與增殖，也是細(xì)胞自噬調(diào)控的關(guān)鍵蛋白[10]。mTOR存在2種復(fù)合形式，根據(jù)其對(duì)雷帕霉素的敏感性差異分為mTORC1和mTORC2。其中對(duì)雷帕霉素敏感的mTORC1是調(diào)控自噬的主要因素，也是多條信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)。

影響或調(diào)控mTOR信號(hào)通路的因素尚未被完全闡明。目前研究較多的有PI3K/AKT/mTOR通路和AMPK/mTOR通路。生長(zhǎng)因子主要通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)mTOR活性。正常情況下，細(xì)胞外的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可通過(guò)受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K催化PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，并在PDK1的協(xié)同下激活A(yù)kt?；罨腁kt磷酸化TSC2，使其從TSC1/TSC2復(fù)合物中解聚，以增強(qiáng)Rheb活性，從而正向調(diào)控mTOR。同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)可使PIP3去磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)PI3K所催化的反應(yīng)，是PI3K/AKT途徑的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[11]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量則主要通過(guò)單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated kinase,AMPK)通路調(diào)節(jié)mTOR的活性。一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)值升高可活化AMPK，被活化的AMPK作用于TSC1/TSC2，進(jìn)而抑制mTOR活性。

1.3 Beclin 1通路Beclin 1是酵母菌ATG6/VSP30在哺乳動(dòng)物的同源基因，亦是最早被發(fā)現(xiàn)的自噬調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子。Beclin 1具有3個(gè)重要結(jié)構(gòu)域：BH3、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled coil domain，CCD)和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域(evolutionarily conserved domain，ECD)。Beclin 1可通過(guò)這些結(jié)構(gòu)域與多種蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，抑制或促進(jìn)自噬發(fā)生[12]。例如，Beclin 1可通過(guò)其CCD和ECD結(jié)構(gòu)域與Vps34結(jié)合，形成Vps34-Beclin1復(fù)合體，促進(jìn)自噬體膜的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)?？棺贤饩€相關(guān)基因產(chǎn)物蛋白(ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG)可直接與Beclin 1的CCD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進(jìn)自噬體成熟，而其亞單位Rubicon與Beclin 1結(jié)合，則抑制自噬體成熟[13-14]。研究顯示，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2也是重要的自噬調(diào)節(jié)蛋白，因其含有與Beclin 1相同的結(jié)構(gòu)域BH3，故Bcl-2可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Beclin 1與Vps34的結(jié)合從而抑制自噬[15]。由此可見(jiàn)，Beclin 1在自噬體形成的過(guò)程中起著重要作用，并與凋亡通路相互影響。

1.4 絲裂原活化蛋白激酶途徑絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protain kinase，MAPK)信號(hào)通路高度保守，廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，并對(duì)其細(xì)胞周期、基因表達(dá)發(fā)揮重要作用。MAPK包括3個(gè)平行激酶：JNK、p38和ERK1/2，其都被認(rèn)為與自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡有關(guān)。研究證明，ERK可通過(guò)抑制mTORC1觸發(fā)自噬，而 ERK特異性磷酸酶對(duì)光致氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧ROS敏感[16]。除上述通路外，泛素樣蛋白系統(tǒng)，miRNA、p53等也對(duì)自噬信號(hào)通路有一定調(diào)節(jié)作用[17]。

2 自噬在視網(wǎng)膜光損傷中的作用

2.1 視網(wǎng)膜光損傷中自噬的保護(hù)作用自噬及其相關(guān)蛋白參與了一系列感光活動(dòng)，且在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)、外核層，及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均有高表達(dá)[18]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以凋亡為靶點(diǎn)，黑米花青素可改善大鼠視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷[19]。以自噬為靶點(diǎn)，飛燕草素可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)自噬從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬性死亡[20]。自噬亦或可成為視網(wǎng)膜光損傷防治的新研究方向。

光感受器細(xì)胞變性和死亡是光致視網(wǎng)膜損傷的主要病理改變，也是一系列相關(guān)疾病，如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)和視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)導(dǎo)致失明的原因[21]。

2.1.1 AMD中自噬的作用藍(lán)光易折射，是引起眩光導(dǎo)致視疲勞的一大原因。其中短波藍(lán)光易導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)早期損傷，是干性AMD 的重要危險(xiǎn)因素[22]。Xia等[23]利用老年C57小鼠視網(wǎng)膜和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigment epithelial cells，hRPE)為模型，以藍(lán)光誘導(dǎo)損傷。損傷后第1天電鏡下觀察到：hRPE線粒體受損，視網(wǎng)膜外節(jié)段結(jié)構(gòu)紊亂。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting，WB)結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白PERK、LC3、Beclin-1上調(diào)，提示自噬啟動(dòng)。損傷后第5天，電鏡觀察到視網(wǎng)膜和光感受器損傷恢復(fù)。WB結(jié)果顯示PERK、LC3、Beclin-1下調(diào)。由自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化可推測(cè)：自噬參與了視網(wǎng)膜光損傷的早期修復(fù)。

大劑量光照可導(dǎo)致RPE中玻璃疣(Drusen，位于RPE和Bruch膜之間的一種異常沉積物)和脂褐素的積累。二者均是AMD發(fā)展的危險(xiǎn)因素[24]。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，脂褐素的主要成分A2E誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)的分泌，并降低RPE生存率。增強(qiáng)自噬可減少炎癥因子和VEGFA的分泌，對(duì)RPE細(xì)胞抵抗A2E毒性具有保護(hù)作用。

視錐細(xì)胞是視網(wǎng)膜光感受器中對(duì)色彩視覺(jué)和視覺(jué)感知至關(guān)重要的細(xì)胞，相對(duì)于視桿細(xì)胞，視錐細(xì)胞在較強(qiáng)光線下仍能正常工作，且有抗強(qiáng)光損傷能力。AMD后期，因視錐細(xì)胞大量丟失，患者視力受到嚴(yán)重?fù)p傷甚至失明。Zhou等[4]敲除自噬基因Atg5阻斷自噬后發(fā)現(xiàn)，視錐細(xì)胞的抗強(qiáng)光傷害的能力降低。說(shuō)明自噬有助于視錐細(xì)胞抗強(qiáng)光損傷，且在AMD后期起到了保護(hù)視力的作用。

Cai等[26]發(fā)現(xiàn)MicroRNA-29可通過(guò)抑制mTORC1活性，促進(jìn)自噬，增加RPE中Drusen的清除率。由此可見(jiàn)，MicroRNA-29有可能成為治療眼部疾患中RPE變性的新治療策略。

2.1.2 RP中自噬的作用RP是視網(wǎng)膜變性最常見(jiàn)的臨床亞型之一，是一種神經(jīng)退行性疾病。因RP影響光感受器的存活能力，故最終可導(dǎo)致失明[27]。Yao等[28]發(fā)現(xiàn)，光損傷促進(jìn)具有細(xì)胞毒性的視覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白生成，其細(xì)胞毒性可導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性。他們敲除自噬基因Agt5中斷自噬，發(fā)現(xiàn)視覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白累積，加速了視神經(jīng)元退化和視網(wǎng)膜變性。而同時(shí)敲掉Agt5和視覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的基因Gnat-1，則發(fā)現(xiàn)視桿細(xì)胞變性率降低，光感受器保存良好。自噬有助于及時(shí)清除視覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，從而達(dá)到保護(hù)光感受器的作用。

2.2 視網(wǎng)膜光損傷中自噬的損傷作用自噬在許多疾病進(jìn)程中體現(xiàn)著雙刃劍效應(yīng)。近年研究顯示，視網(wǎng)膜光損傷中自噬不僅有以上保護(hù)作用，在一定條件下也有加重?fù)p傷增加細(xì)胞死亡率的效果。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，以可見(jiàn)光照射小鼠光感受器細(xì)胞(661W細(xì)胞)可激活MAPK通路，導(dǎo)致顯著自噬，細(xì)胞死亡率上升。而分別使用通路抑制劑阻斷MAPK的3個(gè)平行激酶途徑：JNK、p38和ERK1/2后發(fā)現(xiàn)：ERK1/2是光誘導(dǎo)661W細(xì)胞死亡的關(guān)鍵，通過(guò)抑制ERK通路抑制了自噬，可明顯降低661W細(xì)胞的光致死率。此研究不僅證明了自噬在視網(wǎng)膜光損傷中可起到加重?fù)p傷的作用，還為阻斷自噬性損傷找到了可能的干預(yù)靶點(diǎn)。目前關(guān)于自噬對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞負(fù)面作用的研究較少，有待未來(lái)進(jìn)一步探索。

雖然目前為止，視網(wǎng)膜光損傷的具體機(jī)制尚不明確，但如果能以自噬為切入點(diǎn)加以研究，或可為視網(wǎng)膜光損傷相關(guān)疾病的防治提供新思路。