,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830000)

近些年來,心腦血管疾病已成為危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,血脂濃度升高會增加心腦血管疾病患者的死亡率。通過飲食方式降低血脂濃度,預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生,引起了人們的廣泛關(guān)注[1-3]。因此,更為健康的天然物質(zhì)的活性成分已經(jīng)成為研究的熱點之一。已有研究證實,多糖的降血脂作用溫和,毒副作用小,對高脂血癥人群具有良好功效[4]。

多糖是由10個以上單糖分子通過糖苷鍵連接形成的天然高分子化合物,具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗癌、抗菌、防輻射和降糖脂等生理活性[5-9]。多糖來源和提取方式的不同,其功能功效也有所不同。目前,對多糖的提取方法主要有溶劑提取法[10]、超聲輔助法[11]、微波輔助提取法[12]和酶提取法[13]等。與其它方法相比,超聲輔助法具有強烈的空化效應(yīng),增加溶劑穿透力,加快多糖溶出速度,既能提高提取率,又不破壞其生物活性。

籽瓜(Citrulluslanatussp.Convarvar.MegulaspemusL.),又名打瓜,主要分布于我國新疆、甘肅、東北及內(nèi)蒙古東部等地區(qū)[14]。籽瓜是新疆重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中占有重要地位,種植面積有21萬公頃,產(chǎn)量已達(dá)30萬噸[15]。籽瓜主要是以取籽加工為主,瓜皮瓜瓤丟棄在田間,造成巨大的資源浪費和環(huán)境污染。籽瓜取籽加工后的副產(chǎn)物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜瓜皮的再利用,不僅能提高籽瓜的經(jīng)濟(jì)價值,還能減少環(huán)境污染。如何提高籽瓜加工副產(chǎn)物的綜合利用率,增加附加值降低生產(chǎn)成本,是決定籽瓜加工業(yè)進(jìn)一步提升的一個重要環(huán)節(jié)。因此,需要對籽瓜有益成分的提取和加工進(jìn)行深入研究,評價籽瓜皮渣中有益成分的功能。籽瓜加工副產(chǎn)物中含有多糖、果膠、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì),其中籽瓜多糖的研究主要集中在抗氧化生物活性方面[16],降血脂活性的研究卻鮮有報道。研究籽瓜中的多糖降血脂活性,驗證籽瓜多糖的食藥作用是提高籽瓜加工副產(chǎn)物利用率的研究方向之一。

本文以新疆籽瓜為試材,優(yōu)化籽瓜多糖超聲輔助的提取工藝,分析考察籽瓜多糖的降血脂作用,并與其他提取物的膽酸鹽結(jié)合試驗結(jié)果作比較,探討籽瓜多糖的降血脂效果,為籽瓜副產(chǎn)物精深加工和多糖的降血脂功效的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽瓜 2018年8月采摘于新疆昌吉籽瓜種植園;石油醚、無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;胃蛋白酶(1∶3000)、胰蛋白酶(1∶250)、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉 上海源葉生物科技有限公司。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-25C冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國SCILOGEX公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;0DD150FL高效熱泵除濕干燥機 廣州晟啟能源設(shè)備有限公司;Centrifuge 5810R大容量離心機 艾本德公司;ML204/2電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 籽瓜干粉的制備 將籽瓜原材料去翠衣皮,切塊,去籽,留瓜瓤,經(jīng)40 ℃低溫干燥48 h后粉碎,經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾得到籽瓜干粉。將籽瓜干粉按原料∶石油醚=1∶3 (W/V)的比例加入石油醚原液,室溫條件下浸泡12 h后,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積,回收石油醚。重復(fù)2次,除去脂溶性雜質(zhì),最后放入40 ℃烘箱內(nèi)干燥,得到籽瓜干粉原料。

1.2.2 籽瓜多糖的提取工藝 參照文獻(xiàn)[17-19]的方法,略作修改。取1 g處理后的原料,以蒸餾水為溶劑,采用超聲波輔助提取。在實驗設(shè)定的溫度、時間、超聲功率等條件下提取籽瓜多糖。提取液于轉(zhuǎn)速為10000 r/min離心10 min,取上層清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至一定體積,加入4倍無水乙醇20 mL,醇沉24 h。8000 r/min離心10 min,取下層沉淀(白色絮狀物質(zhì)),用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次,Sevag法(正丁醇∶氯仿=1∶4)脫去蛋白,-60 ℃冷凍干燥得到籽瓜粗多糖。苯酚-硫酸法測定多糖含量,多糖得率計算公式如(1)式:

式(1)

1.2.3 籽瓜多糖提取單因素實驗

1.2.3.1 提取溫度對籽瓜多糖得率率的影響 固定超聲功率為500 W,以料液比為1∶30 g/mL,提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃的條件下提取2 h。平行提取3次,考察提取溫度對多糖得率的影響。

1.2.3.2 提取時間對籽瓜多糖得率的影響 以料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為500 W、提取溫度為40 ℃的條件下,分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。平行提取3次,考察提取時間對多糖得率的影響。

1.2.3.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 以超聲功率為500 W,提取溫度為40 ℃,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的條件下提取2 h。平行提取3次,考察料液比對多糖得率的影響。

1.2.3.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 以料液比1∶30 g/mL,提取溫度為40 ℃,超聲功率分別為100、200、300、400、500 W的條件下提取2 h。平行提取3次,考察超聲功率對多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素優(yōu)化試驗的基礎(chǔ)上以最優(yōu)提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、和超聲功率(D)為自變量,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理[19],進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。以籽瓜粗多糖得率為響應(yīng)值,優(yōu)化籽瓜多糖的提取工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 體外降血脂作用的研究

1.2.5.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[20]的方法,略作修改,分別繪制甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制甘氨膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL分別置于不同具塞試管中,每只試管加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4溶液。之后于70 ℃水浴加熱20 min,取出放置冰浴5 min,在波長為387 nm處測定吸光度。以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)分別繪制甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.2.5.2 膽酸鹽結(jié)合實驗 參照文獻(xiàn)[20]的方法,略作修改。分別移取3 mL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL籽瓜多糖溶液兩份于100 mL三角瓶中,每個三角瓶分別加入3 mL 10 mg/mL胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液,在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h(模擬胃消化環(huán)境),0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.3。隨后,加入4 mL 10 mg/mL胰蛋白酶溶液,37 ℃下恒溫振蕩器振蕩1 h(模擬腸道環(huán)境)。一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉;另一份樣品三角瓶中加入4 mL 0.5 mmol/L?；悄懰猁}。在37 ℃的恒溫振蕩器內(nèi)振蕩1 h,于4000 r/min離心20 min,取上清液,用比色法于387 nm處測定吸光度值,每個樣品平行測定3次,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算剩余甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}含量,所加入甘氨膽酸鹽或牛磺膽酸鹽總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結(jié)合率,以百分比表示。計算公式如(2)(3)式:

式(2)

式中:c0為甘氨膽酸鈉加入量,μmol;c1為甘氨膽酸鈉剩余量,μmol。

式(3)

式中:c2為?；悄懰徕c加入量,μmol;c3為牛磺膽酸鈉剩余量,μmol。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010作圖表。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對籽瓜多糖得率的影響 由圖1a可知,溫度對于籽瓜多糖的得率有著顯著(P<0.05)的影響。隨著溫度的上升,籽瓜多糖得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,當(dāng)溫度為30～40 ℃時,籽瓜多糖得率隨溫度的上升，增加的趨勢最迅速,多糖得率在40 ℃時達(dá)到最大值,在一定范圍內(nèi),提取溫度的升高,有利于分子的運動和多糖的溶出;溫度過高則會影響到多糖的結(jié)構(gòu),會使多糖得率降低。因此選擇的最佳提取溫度為40 ℃。

2.1.2 提取時間對籽瓜多糖得率的影響 由圖1b可知,隨著提取時間的增加,籽瓜多糖的得率先升高后下降,在2.0 h時達(dá)到最大值。由于超聲波的空化效應(yīng)增大,溶劑進(jìn)入溶質(zhì)內(nèi)部的能力增強,較短時間內(nèi),超聲開始對細(xì)胞進(jìn)行破碎,使得多糖更容易從細(xì)胞中釋放出來,使得整個提取時間縮短,得率增大。隨超聲時間的增長,多糖分子中的五碳環(huán)或六碳環(huán)可能裂解成為可溶于乙醇的寡糖、低聚糖或單糖,造成多糖在醇沉過程中溶解損失增加;此外,超聲波空化效應(yīng)作用力減小,會影響多糖溶出。這些因素都會導(dǎo)致多糖得率的下降[21-22]。比較分析消耗能量、浸提時間和原料浪費等各種因素,選擇的提取時間為2.0 h。

2.1.3 料液比對籽瓜多糖得率的影響 由圖1c可知,多糖得率隨料液比的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在料液比為1∶30 g/mL時，多糖得率最大。這可能是溶劑體積的增加使得溶液中多糖濃度下降,多糖分子擴(kuò)散的壓力差增大,有利于多糖分子的擴(kuò)散和溶出。當(dāng)多糖的擴(kuò)散量達(dá)到一定的值時,繼續(xù)加大溶劑比例,也不會使更多多糖擴(kuò)散[23]。并且料液比增大,可能會致使后續(xù)的提取濃縮過程中隨時間增加,多糖損失升高,導(dǎo)致多糖得率下降。因此,選擇料液比為1∶30 g/mL。

2.1.4 超聲功率對籽瓜多糖得率的影響 由圖1d可知,多糖得率的變化隨著超聲波功率的增大呈現(xiàn)先增加后緩慢降低至平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)提取功率為200 W時多糖得率最大,隨著超聲功率的繼續(xù)增加,多糖得率基本保持不變。這是因為隨超聲功率增大，超聲的空化作用隨之加強,細(xì)胞破裂多糖加速溶出;當(dāng)超聲波功率增大到一定值時,多糖得率不會再增加基本保持不變[24]。因此,選擇適宜超聲波功率為200 W。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果及方差分析 通過單因素實驗發(fā)現(xiàn):在提取過程中提取溫度為40 ℃,提取時間為2.0 h,料液比為1∶30 g/mL,超聲功率為200 W時,籽瓜粗多糖得率最大。如表2所示,將提取溫度、提取時間、料液比和超聲功率作為研究的對象,籽瓜粗多糖得率為響應(yīng)值,共得到29個實驗點,利用Design-Expert 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,確定籽瓜粗多糖得率對以上因素的二次多項回歸模型為:

Y=5.98+0.17A+0.26B+0.45C+0.45D-0.017AB-0.12AC-0.12AD-0.010BC-5.000E-003BD-0.03CD-0.51A2-0.21B2-1.79C2-0.089D2

圖1 提取溫度(a)、提取時間(b)、料液比(c)和超聲功率(d)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature(a),extract times(b),ratios of material to water(c)and ultrasonic power(d)on the yield of polysaccharide

表2 籽瓜粗多糖提取響應(yīng)分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

采用超聲輔助提取籽瓜多糖的回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù),回歸模型的方差分析如表3所示。通過統(tǒng)計學(xué)分析可知,該試驗選用的模型極顯著(P<0.0001),方差的失擬項不顯著(P=0.0559>0.05),所選模型的R2為0.9950,說明模型的選擇是合適的,可用于超聲輔助提取籽瓜多糖的分析與預(yù)測。同時,表3結(jié)果還顯示,在本試驗設(shè)計中:A、C項為高度顯著(P<0.0001),AC、AD項為顯著項(P<0.05),A2、B2、C2項均為高度顯著項(P<0.0001),D2項為顯著項(P<0.05)。

表3 次多項式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

注:*表示P<0.05,差異顯著;**表示P<0.01,差異極顯著;***表示P<0.001,差異高度顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析 如圖2所示,由曲面的分析可預(yù)測、檢驗確定變量和響應(yīng)值之間的相互關(guān)系,響應(yīng)面越陡峭,表現(xiàn)出各個因素之間的兩兩交互作用越顯著[25-26]。提取溫度和料液比交互作用顯著。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of interaction of various factors

2.2.3 最佳提取工藝驗證 根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果,得到的最佳提取工藝條件是:提取溫度為41.318 ℃、提取時間為2.039 h、料液比為1∶30.078 g/mL、超聲功率為216.750 W?？紤]到實際情況對上述條件加以修正,最終的優(yōu)化條件為提取溫度為42 ℃、提取時間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W,在該參數(shù)下,進(jìn)行3組平行實驗,所得多糖得率平均值為6.03%,與理論預(yù)測值的6.024%相近,說明該回歸方程能較準(zhǔn)確反應(yīng)各因素對籽瓜多糖提取率的影響,證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化籽瓜多糖提取率回歸模型可行。

2.3 籽瓜多糖體外降血脂能力分析

2.3.1 甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖3a和圖3b可知:甘氨膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=2.8655x+0.0212,R2=0.9991,線性關(guān)系良好;牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=2.4664x+0.0126,R2=0.9990,線性關(guān)系良好。

圖3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)與牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.3 Tandard curve of glycine sodium cholate(a) and taurine sodium cholate(b)

2.3.2 籽瓜多糖對膽酸鹽的結(jié)合能力 從圖4可以看出,籽瓜多糖與?；悄懰徕c的結(jié)合量比與甘氨膽酸鈉的結(jié)合量多,即籽瓜多糖與牛磺膽酸鹽的結(jié)合能力更強,并且與二者的結(jié)合量均隨多糖濃度的增加而升高。當(dāng)籽瓜多糖的濃度達(dá)到2.5 mg/mL時,籽瓜多糖和甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁}的結(jié)合率分別達(dá)到62.67%和69.27%。證實籽瓜多糖具有較好的體外降血脂活性。隨著繼續(xù)增加籽瓜多糖的量,結(jié)合率的上升變得緩慢;當(dāng)籽瓜多糖濃度達(dá)到3.5 mg/mL時,籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到66.17%和70.27%。但僅是籽瓜濃度為2.5 mg/mL時結(jié)合率的1.06倍和1.01倍。

圖4 籽瓜多糖對膽酸鹽結(jié)合能力Fig.4 Capacity of polysaccharide from seed melon to bind sodium cholate

粗多糖中較高的膽酸結(jié)合能力是由于糖蛋白與多糖形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu),有利于結(jié)合膽酸[27]。籽瓜多糖的濃度為2.5 mg/mL時,與兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率明顯高于4 mg/mL的黑木耳多糖[28],也略高于3.5 mg/mL桑葉茯磚茶多糖[29]和4 mg/mL裙帶菜孢子多糖[30]與兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率。說明低濃度的籽瓜多糖有很好的體外降血脂活性,可作為具有潛在價值的降血脂保健食品原料。然而它與茶樹花渣乙醇萃取物[31]相比較,兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率卻略低。籽瓜多糖是以籽瓜廢棄的瓜瓤作為原材料,采用水作為溶劑,提取成本較低。因而選取籽瓜為原材料制備的籽瓜多糖,會大大降低成本,提高籽瓜加工附加值。

3 結(jié)論

本實驗中篩選出最佳提取工藝條件為提取溫度為42 ℃、提取時間為2 h、料液比為1∶30 g/mL、超聲功率為220 W。經(jīng)實驗驗證,3次平行實驗求得平均得率為6.03%,與理論預(yù)測值較接近。

體外降血脂結(jié)果可以得出:當(dāng)籽瓜多糖濃度達(dá)到2.5 mg/mL時,籽瓜多糖與甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的結(jié)合率分別達(dá)到62.67%和69.27%。與其他提取物和兩種膽酸鈉鹽的結(jié)合率做對比,低濃度籽瓜多糖有很好的降血脂效果,可以作為一種植物源降血脂保健藥物,這一發(fā)現(xiàn)為籽瓜資源的利用提供了新的研究思路,也為籽瓜在醫(yī)藥食品行業(yè)開發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。