唐 標 尹抗抗 (湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院,長沙 410028)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球激增的健康問題，是肝臟疾病和心血管代謝疾病死亡的關鍵危險因素[1]。部分NAFLD患者會進展為肝炎、肝纖維化和肝硬化，最終發(fā)展為肝癌、肝衰竭，NAFLD的發(fā)病機制與脂質代謝紊亂、脂質蓄積、胰島素抵抗、內質網(wǎng)應激以及炎癥等多種因素有關[2,3]。

細胞焦亡是一種炎癥相關的可調控性細胞死亡方式，gasdermin D(GSDMD)蛋白是細胞焦亡的執(zhí)行分子，GSDMD被活化剪切生成的GSDMD的N端(GSDMD-N)會形成聚合物并與細胞膜上的脂質分子形成孔道，導致細胞腫脹破裂，釋放大量促炎因子，加重炎癥反應[4]。GSDMD的活化由Caspase-1/4/5/11介導，Caspase-4/5為大鼠和小鼠種屬Caspase-11在人體中的同源蛋白，由Caspase-1活化介導的細胞焦亡，為經典的細胞焦亡途徑；而由脂多糖(LPS)誘導的Caspase-4/5/11活化而誘導的細胞焦亡為非經典的細胞焦亡途徑[5,6]。已有研究揭示細胞焦亡介導了NAFLD中肝細胞的死亡以及加重炎癥反應和纖維化的進程，成為NAFLD干預的重要靶點[7,8]。

降脂理肝湯由澤瀉、丹參、決明子、郁金、海藻和荷葉6味中藥組成。臨床觀察和實驗研究表明，降脂理肝湯能有效干預NAFLD[9]。前期實驗研究表明，降脂理肝湯能調節(jié)高脂飲食誘導的NAFLD大鼠脂代謝，抑制炎癥反應，減輕肝臟病理損傷，并且能抑制NLRP3炎癥小體的活化[10-12]。但是降脂理肝湯在NAFLD中的抗炎機制以及非經典的細胞焦亡途徑是否介導其抗炎機制還不明確，因此本研究觀察降脂理肝湯對NAFLD中非經典的細胞焦亡途徑的影響，探討降脂理肝湯干預NAFLD的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物 降脂理肝湯由澤瀉10 g，決明子30 g，丹參10 g，郁金10 g，海藻30 g，荷葉10 g組成，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房，經湖南中醫(yī)藥大學陳曉陽教授鑒定為治療標準復合要求的藥材。上述藥物加8倍量水浸泡30 min 后，沸后煎煮1 h后過濾，再加6倍量水沸后煎煮1 h過濾，兩次藥液混合，于65℃減壓旋蒸濃縮，濃縮成2 g/ml的濃縮液，于4℃冷藏儲存，臨用前用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.1.2動物 健康SPF級SD雄性大鼠，體質量(150±10)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號為SYXK(湘)2017-0003。實驗前，在動物房適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度(22±2)℃，自然晝夜節(jié)律光照，自由進水攝食。整個動物實驗方案獲得湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會的批準，實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.3試劑 水合氯醛(批號：8MQ20-CC)購自梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；Western及IP細胞裂解液(批號：P0013)購自碧云天；蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，100 × DMSO儲液，批號：B14002)，磷酸酶抑制劑Cocktail (100×B15002，批號：B15002)購自Bimake；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(批號：GN-R30172)、大鼠L-18 ELISA試劑盒(批號：GN-R30168)、大鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號：GN-R31092)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(批號：GN-R30201)購自蓋寧生物；LPS檢測試劑盒(批號：H178)購自南京建成生物工程研究所；GSDMD鼠單克隆抗體(批號：sc-393581)、Caspase-11(批號：sc-374615)鼠單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechno-logy；GSDMD-N兔單克隆抗體(批號：93709)購自Cell Signaling Technology；β-actin鼠抗單克隆抗體(批號：A5316)購自Sigma；山羊抗兔二抗(批號：AP132P)、山羊抗鼠二抗(批號：AP124P)購自Merck。

1.1.4儀器 酶標儀、電泳儀、轉膜儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型的建立 參照前期研究[13]，采用高脂飼料喂養(yǎng)12周的方法建立NAFLD大鼠模型，高脂飼料配方：脂肪10%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、蛋黃粉5%，標準大鼠飼料82.5%，高脂飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.2.2動物分組和藥物干預 SD大鼠隨機分為正常組、模型組、降脂理肝湯組，其中降脂理肝湯給藥劑量參照前期研究，按照動物與人體間的等效劑量換算，設3個劑量，分別為降脂理肝湯低劑量組(2.3 g/kg)、降脂理肝湯中劑量組(4.6 g/kg)和降脂理肝湯高劑量組(9.2 g/kg)。正常組標準飼料喂養(yǎng)，模型組和降脂理肝湯高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)12周后，每組隨機抽取3只，取肝組織蘇木精-伊紅染色(HE染色)，觀察組織病理學變化，觀察到高脂飼料肝臟出現(xiàn)不同程度的脂肪變性和空泡樣變，驗證模型成功后，進行藥物干預，降脂理肝湯采用灌胃給藥的方式，均1次/d。連續(xù)6周，每周稱重1次，按體質量調整給藥量。正常組和模型組每天灌胃給予等量的生理鹽水，藥物干預期間，喂養(yǎng)方式同前。干預結束后，取各組大鼠肝門靜脈和腹主動脈血液和肝臟待檢測。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達量 每組5只大鼠，取大鼠同部位肝臟組織100 mg，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液1 ml于冰上勻漿30 min，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調平各樣品蛋白濃度。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離后，轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用抗GSDMD(1∶1 000)、GSDMD-N(1∶1 000)、Caspase-11(1∶500)和β-actin(1∶5 000)一抗抗體4℃孵育過夜，洗滌后加HRP標記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌后ECL顯色曝光，用Quantity One灰度分析軟件進行圖像定量分析，測定目的蛋白的相對光密度值(IOD)，以β-actin為內參蛋白，計算目的蛋白IOD與內參蛋白IOD的比值，以此表示蛋白表達量。

1.2.4門靜脈血清LPS水平檢測 門靜脈血液靜置離心后提取血清，按照檢測試劑盒說明書檢測，首先向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物標記的識別抗原，于37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入親和素HRP，于37℃孵育1 h，在450 nm波長下測吸光值，以標準孔吸光值及其對應濃度繪制出標準曲線，計算各組血清中LPS的濃度。

1.2.5血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平檢測 大鼠腹主動脈血液靜置離心后提取血清，按照試劑盒說明書進行檢測，試劑盒于室溫下平衡20 min后，將稀釋好的樣品或不同濃度標準品按照100 μl/孔加入相應孔中，每孔設置1復孔，同時設置本底校正孔，即空白孔，設置方法為該孔只加TMB溶液和終止液，用封板膜封住反應孔，室溫孵育120 min后，洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干，加入生物素化抗體100 μl/孔，封孔后室溫孵育60 min，洗板5次，加入辣根過氧化物酶標記100 μl/孔，室溫避光孵育20 min，洗板5次，加入顯色劑TMB溶液100 μl/孔，室溫避光孵育20 min，加入終止液50 μl/孔，混勻后立即測量A450值。根據(jù)標準品濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過樣品吸光度值和標準曲線計算樣品濃度。

2 結果

2.1降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝組織GSDMD蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與正常組相比，高脂飲食誘導的模型組大鼠肝組織GSDMD和GSDMD-N蛋白表達量顯著增加(P<0.01)；降脂理肝湯藥物干預后，大鼠肝組GSDMD和GSDMD-N蛋白表達量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，結果見圖1。

2.2降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物組肝組織Caspase-11蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，結果見圖2。

2.3降脂理肝湯對NAFLD大鼠肝門靜脈血清中LPS水平的影響 與正常組相比，高脂飲食誘導的模型組大鼠肝門靜脈血清LPS水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物的干預均能顯著降低大鼠肝門靜脈血清LPS水平，并呈劑量依賴性(P<0.01)，結果見圖3。

2.3降脂理肝湯對NAFLD大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平的影響 檢測結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，降脂理肝湯藥物組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結果見圖4。

圖1 降脂理肝湯對大鼠肝組織GSDMD蛋白表達的影響

圖2 降脂理肝湯對大鼠肝組織Caspase-11蛋白表達的影響

圖3 降脂理肝湯對大鼠肝門靜脈血清LPS的影響

圖4 降脂理肝湯對大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平的影響

3 討論

前期的實驗研究揭示，降脂理肝湯可降低高脂飲食誘導的NAFLD大鼠體重、肝重和肝指數(shù)，調節(jié)脂代謝，改善脂質過氧化，改善肝功能和肝臟病理損傷，其機制與抑制炎癥反應、調控腸道菌群有關[10-14]。

炎癥反應作為NAFLD發(fā)病機制的核心環(huán)節(jié)在NALFD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，細胞焦亡介導了NAFLD中的炎癥反應，成為NAFLD干預的重要靶點[8]。已有的研究揭示，GDSMD蛋白作為細胞焦亡的執(zhí)行蛋白，介導了NAFLD進展過程，GSDMD蛋白被剪切活化后生成GSDMD-N，GDDMD-N導致細胞穿孔腫脹破裂，釋放大量促炎因子，加重炎癥反應，抑制GDSMD的活化能阻斷NAFLD疾病的進展[15]。本研究結果顯示，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠，GSDMD蛋白及其活化后的GSDMD-N表達明顯增加，而降脂理肝湯的干預能降低GSDMD和GSDMD-N的水平，表明降脂理肝湯能調控GSDMD的活化。

在非經典的細胞焦亡途徑中，LPS可直接活化的Caspase-4/5/11，活化Caspase-4/5/11剪切GDSMD誘導細胞焦亡。本研究結果顯示，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝臟組織中，Caspase-11的水平明顯升高，而降脂理肝湯的干預能降低能顯著降低Caspase-11的水平，提示降脂理肝湯可能通過Caspase-11來調控GSDMD蛋白的活化。已有研究表明在NAFLD中腸道菌群的紊亂以及腸道黏膜的受損可導致腸道內革蘭氏陰性桿菌溶解釋放的LPS進入門靜脈血液加重NAFLD肝臟炎癥和加快疾病進展[16-18]。本研究結果顯示，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝門靜脈血清中LPS含量顯著升高，而降脂理肝湯的干預能顯著降低大鼠肝門靜脈血清中LPS含量，我們前期實驗研究揭示，降脂理肝湯能調控NAFLD大鼠腸道菌群，修復腸黏膜損傷，減少LPS入血[13,19]，提示降脂理肝湯可能通過降低NAFLD大鼠門靜脈血清中LPS含量，調控Caspase-11和GSDMD的活化。

細胞焦亡的發(fā)生會導致IL-1β和IL-18等促炎因子的釋放，而促炎因子會加重NAFLD中的炎癥反應[20,21]。因此我們進一步觀察了降脂理肝對血清中促炎因子的影響，實驗結果顯示，高脂飲食的NAFLD大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6水平明顯升高，而降脂理肝湯的干預能顯著降低血清中IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的水平，這提示降脂理肝湯能降低NAFLD大鼠促炎因子的水平。

本研究結果顯示高脂飲食誘導的NAFLD大鼠，存在非經典的細胞焦亡途徑的活化，IL-1β和IL-18等促炎因子水平明顯升高，而降脂理肝湯能抑制NAFLD大鼠中非經典細胞焦亡途徑的活化，降低促炎因子的水平，近期有研究揭示抑制細胞焦亡能有效減輕NAFLD損傷以及抑制非經典的細胞焦亡途徑能有效干預酒精性肝炎的進展[22，23]，提示降脂理肝湯可能通過調控非經典的細胞焦亡途徑干預NAFLD。

綜上所述，降脂理肝干預NAFLD的機制可能與抑制非經典的細胞焦亡途徑，降低促炎因子的水平有關。