顏 妍 肖偉利 鐘明月 黃 建 李欣益 吳學(xué)梅 王玉珍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系，呼和浩特 010018)

蒙古黃芪(Astragalus mongholicus Bunge)是豆科黃芪屬植物，是一味補(bǔ)益類中藥，其在保護(hù)心肌、調(diào)節(jié)血壓和提高免疫力等方面有很好的療效。蒙古黃芪多糖(astragalus polysacharin，APS)是蒙古黃芪中含量最多的主要活性成分之一，包括雜多糖、葡聚糖、中性多糖和酸性多糖，而且蒙古黃芪多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等藥理作用[1，2]。除此之外，現(xiàn)有研究顯示蒙古黃芪多糖還具有調(diào)節(jié)血糖和血脂的作用[3]。隨著人們生活水平的提高，糖脂代謝紊亂的發(fā)生率也在增加，但蒙古黃芪多糖對其的影響及其機(jī)制研究還很缺乏。

地塞米松(dexamethasone，DEX)是一類具有抗炎、抗內(nèi)毒素，抑制免疫等藥理作用的糖皮質(zhì)激素，但當(dāng)長期或大劑量使用時(shí)則會出現(xiàn)諸多副作用，當(dāng)前已有實(shí)驗(yàn)表明過量地塞米松會導(dǎo)致血脂異常[4]。近年來，代謝綜合征的患病率和發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害全球公眾健康，而糖脂代謝紊亂是代謝綜合征的重要組成部分。能夠誘發(fā)糖脂代謝紊亂的誘因有許多，比如晝夜失調(diào)、菌群失調(diào)、長期的高脂飲食以及胰島素抵抗等[5]。而且肝臟是糖代謝過程中起關(guān)鍵作用的器官，它是糖酵解、糖異生以及糖原合成與分解的重要臟器，因此肝臟損害會導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)的嚴(yán)重失衡[6]。在此次研究中，我們采用地塞米松誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠糖脂代謝紊亂模型。氧化應(yīng)激是諸多肝臟疾病共同的發(fā)病機(jī)制，Nrf2-ARE是體內(nèi)一條極為重要的抗氧化應(yīng)激信號通路，在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[7]。CAT是過氧化物酶，也是氧化應(yīng)激里的重要成員之一。由于蒙古黃芪多糖具有抗氧化作用，但其發(fā)揮抗氧化作用是否與Nrf2-ARE和CAT有關(guān)，并且對地塞米松誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂是否有作用尚不明確。因此，此次實(shí)驗(yàn)采用地塞米松誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠糖脂代謝紊亂模型，研究蒙古黃芪多糖是否通過Nrf2-ARE和CAT對其有所緩解，為糖脂代謝紊亂的緩解和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)用黃芪為蒙古黃芪，蒙古黃芪多糖由本實(shí)驗(yàn)室分離提取，SD雄性大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司。地塞米松磷酸鈉注射液購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司；組織蛋白提取液購自康為世紀(jì)生物有限公司;BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自上海生物工程有限公司;總RNA抽提試劑Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa生物公司;胰島素ELISA檢測試劑盒購自EMD Millipore corporation;GCLC抗體購自愛博泰克生物科技有限公司；β-actin抗體購自Proteintech公司；Western blot 二抗購自LI-COR公司。

1.2方法

1.2.1動物實(shí)驗(yàn)方法 50只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g隨機(jī)分為5組，即空白組(Control)、地塞米松組(DEX)、蒙古黃芪多糖低劑量組(DEX+APS50)、蒙古黃芪多糖中劑量組(DEX+APS100)和蒙古黃芪多糖高劑量組(DEX+APS200)。實(shí)驗(yàn)鼠給予普通維持飼料，自由飲用水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)兩周。2周后，DEX組、DEX+APS50組、DEX+APS100組和DEX+APS200組分別給予1 mg/kg的地塞米松磷酸鈉注射液，空白組給予等體積的無菌水，腹腔注射給藥。DEX+APS50組、DEX+APS100組和DEX+APS200組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg的蒙古黃芪多糖灌胃，空白組和DEX組給予等體積無菌水。實(shí)驗(yàn)期間每3 d測一次空腹血糖，并且密切關(guān)注大鼠的生活狀態(tài)，14 d后禁食不禁水，腹主動脈取血，處死大鼠，收集血液和肝臟，部分肝臟置于4%中性甲醛中固定，用于HE染色，其余-80℃凍存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后進(jìn)行血清的GLU、FINS、ALT、AST、TG和CHOL等生化指標(biāo)的檢測。

1.2.2血清中FINS、ALT、AST和TG等生化指標(biāo)的檢測 采集的血液靜置4 h凝固后，4℃，3 000 r/min離心10 min，分離血清，立即檢測。血清中的FINS含量通過胰島素ELISA檢測試劑盒檢測；血清中ALT、AST和TG等指標(biāo)含量通過全自動生化分析儀測定，測定結(jié)果由內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2.3肝臟組織病理形態(tài)學(xué)檢測 4%中性甲醛固定的肝臟組織，經(jīng)石蠟包埋切片后，用蘇木素-伊紅染色(HE)，最后置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

1.2.4Real-time PCR分析 肝臟組織采用Triol法提取RNA，然后以500 ng RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR檢測，采用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

1.2.5Western blot檢測肝臟組織中GCLC的表達(dá)情況 肝臟組織按照重量∶體積=1∶9的比例加入組織蛋白抽提液，經(jīng)破碎后12 000 r/min離心10 min得到10%的肝臟勻漿。利用BCA試劑盒方法檢測蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離所需蛋白，半干法轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。5%脫脂奶粉封閉3 h后，按1∶1 000分別加入GCLC和β-actin抗體，4℃孵育過夜。第二天經(jīng)TBST洗膜5次后，按1∶10 000加入Goat anti-Rabbit IRDye?800 CW 二抗室溫孵育90 min，再次洗膜后用Odyssey紅外激光掃描成像儀分別檢測GCLC的表達(dá)量，并分析其變化。

2 結(jié)果

2.1蒙古黃芪多糖對血清中ALT、AST和ALP水平的影響 血清中的ALT、AST和ALP一般作為肝臟功能是否正常的主要指標(biāo)。如圖1所示，給予地塞米松后，DEX組ALT、AST和ALP水平顯著比Control組升高(P<0.01,P<0.05)；但給予蒙古黃芪多糖后，與DEX組相比，APS給藥組均顯著降低了ALT、AST和ALP水平(P<0.01)，說明蒙古黃芪多糖可能通過下調(diào)ALT、AST和ALP水平來緩解地塞米松誘導(dǎo)的肝損傷，其中當(dāng)蒙古黃芪多糖給予200 mg/kg 時(shí)效果相對最好。

表1 Real-time PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences of Real-time PCR

Primer namePrimer sequence(5'-3')β-actin sense CGCGAGTACAACCTTCTTGCβ-actin antisenseATACCCACCATCACACCCTGGNrf-2 sense CCCAGCAGGACATGGATTTGNrf-2 antisense TTTGGGAATGTGGGCAACCTGCLC sense GCACATCTACCACGCAGTCAAGCLC antisense ATCGCCGCCATTCAGTAACAACHO-1 senseGGTCCTGAAGAAGATTGCGHO-1 antisenseAAGACAGCCCTACTTGGTTCAT sense GTACAGGCCGGCTCTCACACAT antisense AACCCGTGCTTTACAGGTTAGC

圖1 蒙古黃芪多糖對血清中ALT、AST和ALP的影響

2.2蒙古黃芪多糖對肝臟組織病理形態(tài)的影響 如圖2所示，Control組肝細(xì)胞絕大多數(shù)正常，部分細(xì)胞有輕微的脂肪變性，肝組織結(jié)構(gòu)完整；給予地塞米松后，DEX組肝臟細(xì)胞普遍存在輕度到中度甚至重度的顆粒變性、水泡變性和脂肪變性。但當(dāng)給予蒙古黃芪多糖后，肝臟病變程度有所恢復(fù)，DEX+APS50組和DEX+APS100組中央顆粒變性相對較輕，可見多數(shù)肝細(xì)胞輕度脂肪變性；DEX+APS200組少量肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度的顆粒變性和脂肪變性。由此可見蒙古黃芪多糖對地塞米松引起的肝臟病變具有一定的緩解作用，其中給予200 mg/kg的時(shí)候緩解效果比較明顯。

2.3蒙古黃芪多糖對血清中糖脂指標(biāo)的影響 糖脂指標(biāo)是糖脂代謝紊亂中最為重要的指標(biāo)，因此我們對血清中的GLU、FINS、TG和CHOL指標(biāo)進(jìn)行檢測并分析。如圖3所示，給予地塞米松后，DEX組的GLU、FINS、TG和CHOL水平均顯著高于Control組(P<0.01)，說明模型是建立成功的。而給予蒙古黃芪多糖后，與DEX組相比，APS給藥組均顯著降低了GLU和CHOL水平(P<0.01)；在FINS和TG水平，DEX+APS50組均顯著降低了其含量(P<0.05)，DEX+APS100組和DEX+APS200組也有所降低。在TG水平，DEX+APS50組和DEX+APS200組顯著降低了其含量(P<0.01,P<0.05),DEX+APS100組也有所降低。由此可知，蒙古黃芪多糖對地塞米松誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂有很好的緩解作用。

2.4蒙古黃芪多糖對Nrf-2信號通路的影響 蒙古黃芪多糖具有很好的抗氧化作用，因此對抗氧化通路Nrf-2及其下游基因進(jìn)行檢測。如圖4所示，給予地塞米松后，DEX組GCLC、HO-1和CAT的mRNA水平均顯著下降(P<0.01)。蒙古黃芪多糖作用后，GCLC和CAT的mRNA水平均顯著升高(P<0.01)；DEX+APS50組和DEX+APS100組Nrf-2和HO-1的mRNA水平均顯著升高(P<0.01,P<0.05),DEX+APS200組也有所升高。說明蒙古黃芪多糖可能是通過抗氧化作用來緩解地塞米松誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂。

圖2 蒙古黃芪多糖對肝臟組織病理形態(tài)的影響

圖3 蒙古黃芪多糖對血清中糖脂指標(biāo)的影響

圖4 蒙古黃芪多糖對抗氧化指標(biāo)的影響

圖5 Western blot檢測蒙古黃芪多糖對GCLC的影響

2.5蒙古黃芪多糖對肝臟中GCLC表達(dá)的影響 如圖5所示，DEX組與Control組相比，GCLC蛋白表達(dá)量降低；蒙古黃芪多糖作用后，DEX+APS50組、DEX+APS100組和DEX+APS200組均顯著提高了GCLC的蛋白表達(dá)量，灰度掃描分析結(jié)果與之相符。說明蒙古黃芪多糖能夠提高GCLC的蛋白表達(dá)量，緩解地塞米松誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂。

3 討論

肝臟是人體葡萄糖和脂質(zhì)代謝的主要器官，在維持血糖穩(wěn)定和脂質(zhì)代謝正常中具有關(guān)鍵作用，因此當(dāng)肝臟損傷時(shí)極易發(fā)生糖脂代謝紊亂[8]。除此之外，肝臟對胰島素極其敏感，而當(dāng)肝臟發(fā)生胰島素抵抗時(shí)會導(dǎo)致肝臟糖脂代謝出現(xiàn)紊亂，肝臟葡萄糖過量生成，脂質(zhì)異常累積[9]。現(xiàn)有研究表明，地塞米松可以誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗以及肝損傷[10，11]。因此，此次實(shí)驗(yàn)選用地塞米松誘導(dǎo)大鼠糖脂代謝紊亂模型。通過檢測血清中肝臟功能主要指標(biāo)和糖脂指標(biāo)，結(jié)合HE染色結(jié)果進(jìn)一步探究蒙古黃芪多糖對糖脂代謝紊亂的影響作用，并且根據(jù)蒙古黃芪多糖的抗氧化作用，通過Nrf2-ARE和CAT抗氧化通路進(jìn)一步揭示APS對糖脂代謝紊亂的緩解機(jī)制。

由上述結(jié)果可知，地塞米松作用于大鼠后，ALT、AST和ALP水平均顯著高于空白組；HE染色結(jié)果顯示DEX組有明顯的脂肪沉積；糖脂指標(biāo)GLU、FINS、TG和CHOL也均顯著高于空白組。說明此次糖脂代謝紊亂模型建立成功。而在給予蒙古黃芪多糖后，APS顯著降低了ALT、AST和ALP水平；從肝臟病理組織形態(tài)學(xué)中也可以看出，APS對肝臟組織的脂肪沉積具有很好的緩解作用；而且APS還顯著降低了GLU、FINS、TG和CHOL含量。除此之外，DEX作用后，Nrf-2、GCLC、HO-1和CAT的含量均明顯降低；而在給予APS后，Nrf-2、GCLC、HO-1和CAT的含量均顯著升高。由此可以說明，蒙古黃芪多糖可以緩解糖脂代謝紊亂。

綜上所述，可以認(rèn)為蒙古黃芪多糖是通過升高Nrf-2、GCLC、HO-1和CAT的含量發(fā)揮抗氧化作用，以此緩解地塞米松誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂。此外，對蒙古黃芪多糖與地塞米松誘導(dǎo)糖脂代謝紊亂的深入研究，有助于更全面的解釋蒙古黃芪多糖對糖脂代謝紊亂的影響機(jī)制，也為蒙古黃芪多糖有望成為代謝性疾病的治療藥奠定了基礎(chǔ)。