孫 娟 葛雨竹 李姿慧 顏貴明 馬克龍 邵 菁 汪天明 汪長中

(安徽中醫(yī)藥大學，合肥 230012)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC) 是發(fā)生在結腸黏膜以及黏膜下層的一種慢性炎癥性腸病，臨床上以體重減輕、腹痛、腹瀉和黏液膿血便為主要癥狀或體征，少數(shù)患者在UC基礎上還可能進一步發(fā)生惡性變。UC病因復雜，一般認為與感染、環(huán)境暴露、遺傳等多因素相關，但無論何種病因，發(fā)病機制均涉及免疫調(diào)節(jié)失常[1]。近年來，腸道菌群紊亂在UC致病過程中的作用受到高度關注[2]。腸道具有豐富的微生態(tài)，細菌表面相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)與腸組織免疫細胞的TLRs等模式識別受體(PRR)相互作用，通過一定的信號轉導，激活炎癥因子表達，導致腸組織免疫炎癥性損傷。TLR4是TLRs家族中的重要成員，通過識別相應的PAMP，激活轉錄因子NF-κB，引發(fā)下游TNF-α等炎癥因子的大量釋放，造成腸組織損傷。鑒于TLR4/NF-κB通路的異?；罨菍е耈C腸組織持續(xù)炎癥的重要誘因，故該通路被認為是治療UC的重要靶標[3，4]。

UC在中醫(yī)上屬于“痢疾”、“泄瀉”、“腹痛”等范疇，其病機涉及脾氣虛弱、運化失調(diào)，故治法常采用健脾益氣、滲濕止瀉。參苓白術散出自《太平惠民合劑局方》，由人參、茯苓、白術、山藥、蓮子肉、薏苡仁、 白扁豆、砂仁、桔梗、甘草十味中藥組成，主治脾虛證。大量臨床實踐表明，參苓白術散治療UC療效顯著，但其作用機制尚不清楚[5，6]。本研究擬從TLR4/NF-κB通路角度探討參苓白術散治療UC的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF 級雄性健康昆明種小鼠，體質(zhì)量(34±2)g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2016-0010。

1.1.2藥品與試劑 參苓白術散購于山西華康藥業(yè)股份有限公司，國藥準字 Z14020346；美沙拉嗪購于上海愛的發(fā)制藥有限公司，國藥準字H20143164；DSS(美國MP Biomedicals公司，批號S0433)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京Leagene生物科技有限公司，編號DH0006)；大便隱血檢測試劑盒(安徽深藍醫(yī)療科技股份有限公司，批號皖20152400174)；小鼠 TNF-α、IL-10、MIF、EGF 定量酶聯(lián)免疫吸附試劑測定(ELISA)試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司，批號06/2019)；免疫組化試劑盒SABC即用型、DAB顯色試劑盒(博士德生物科技有限公司，批號分別是14E14L24C2722、14A18B22)；NF-κB、TLR4抗體(博士德生物科技有限公司，批號26j7543、16c5074)。

1.1.3儀器 BX51顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，H1-16KR型冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司)，Thermo Labserv K3型酶標儀(上海沃元科技有限公司)，YD-6L生物組織冷凍包埋機、YD-315輪轉式切片機、YD-AB攤烤片機(金華市益迪醫(yī)療設備有限公司)。

1.2方法

1.2.1分組及給藥[6]60只小鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組、參苓白術散低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，小鼠飲用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液1周造成UC模型。造模成功后按體表面積法，參苓白術散高、中、低劑量組給予劑量分別是31.2、15.6、7.8 g/kg，空白組和模型組小鼠按 20 ml/kg給予生理鹽水；美沙拉嗪組按0.40 g/kg 給予美沙拉嗪片劑水溶液；灌胃1次/d，共14 d。動物飼養(yǎng)期間自由飲食及飲水。

1.2.2標本采集 禁食24 h的小鼠經(jīng)3.5% 水合氯醛麻醉后眼球取血，采血后處死動物并取整段結腸測量長度。在結腸病變處截取1～2 cm 投入4%多聚甲醛溶液固定，剩余結腸組織凍存管分裝，-80℃冰箱保存。

1.2.3指標檢測

1.2.3.1小鼠一般情況及DAI評分[6]治療周期結束后，觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動、毛色光澤、腹瀉、黏液便、血便等一般情況；對小鼠進行 DAI 評分，包括體質(zhì)量、大便性狀、隱血情況(隱血便試紙法)，評分標準由體質(zhì)量下降分數(shù)、大便性狀分數(shù)、便血分數(shù)三部分組成，計算公式： DAI=(體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3。

1.2.3.2結腸長度、質(zhì)量 取材時準確測量結腸自然長度及稱量質(zhì)量。

1.2.3.3結腸組織病理學觀察 結腸組織由多聚甲醛固定后酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，包埋后中性樹脂封片，在切片機上切成 4 μm厚度組織片，進行 HE 染色，光學顯微鏡下觀察小鼠結腸形態(tài)和病理損傷。

1.2.3.4ELISA法檢測血清中TNF-α、MIF、IL-10、EGF含量 取血后室溫靜置1 h，再于離心機上3 000 r/min離心10 min，取上清液。嚴格按照 ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α、MIF、IL-10、EGF 水平。于酶標儀450 nm 波長下測定 OD值，計算樣品濃度。

1.2.3.5免疫組化法觀察結腸病理組織中NF-κB和TLR4的表達 取制好的蠟塊，切4 μm厚的石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟，梯度75%乙醇水化，PBS水洗后滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復后，自然冷卻，滴加5% 封閉液封閉20 min。每張切片滴加一抗NF-κB或TLR4，4℃孵育過夜，PBS緩沖液沖洗后滴加生物素化羊抗兔 IgG，37℃孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗后滴加試劑SABC，37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗。室溫DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察結腸組織中 NF-κB 和 TLR4 的表達情況，并用 Image J軟件計算平均光密度。

2 結果

2.1參苓白術散對UC小鼠一般情況及DAI評分的影響 與空白組相比，模型組小鼠出現(xiàn)活動減少、反應遲鈍、豎毛、毛色失去光澤、大便稀、有血便及黏液便、大便潛血為陽性，體質(zhì)量減輕。見圖1。參苓白術散低、中、高劑量組小鼠的上述癥狀較模型組有不同程度減輕。與空白組相比，模型組小鼠DAI評分顯著升高(P<0.01)；給藥第一周與模型組比較，各給藥組均有不同程度減輕，DAI評分降低但無統(tǒng)計學差異；給藥第二周與模型組比較，參苓白術散劑量中劑量組與美沙拉嗪組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。DAI 評分結果見表1 。

2.2參苓白術散對UC小鼠結腸長度和重量的影響 與空白組比較，模型組小鼠的結腸長度整體上縮短顯著且單位結腸重量明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，參苓白術散低、中、高劑量組小鼠結腸長度改善趨勢顯著(P<0.01)，單位結腸重量上，除低劑量組無明顯差異，余下各組降低顯著(P<0.01)。見圖2。

2.3參苓白術散對UC小鼠結腸組織病理學的影響 與空白組比較，模型組結腸黏膜炎性細胞浸潤明顯，腺體排列損傷嚴重，層次不清，隱窩結構異常，不同程度出現(xiàn)隱窩分支及扭曲，隱窩數(shù)量減少，更有黏膜表面不平，杯狀細胞減少； 參苓白術散低、中劑量治療后，UC小鼠結腸黏膜病變有一定程度的改善，高劑量治療和美沙拉嗪治療后小鼠結腸黏膜病變改善更加明顯。見圖3。

圖1 各組小鼠體重變化

2.4參苓白術散對UC小鼠血清內(nèi) TNF-α、MIF、IL-10、EGF含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清內(nèi)TNF-α、MIF含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，參苓白術散中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清TNF-α 含量顯著降低(P<0.01)，其中參苓白術散低劑量組含量明顯下降，參苓白術散低、中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清內(nèi)MIF含量顯著降低(P<0.01)；與空白組比較，模型組小鼠血清內(nèi)IL-10、EGF含量降低顯著(P<0.01)，與模型組比較，參苓白術散中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清IL-10含量上升顯著(P<0.01)，參苓白術散低、中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清EGF含量上升顯著(P<0.01)。見圖4 。

GroupDAIBeforeadministrationTreatmentfor 1 weekTreatmentfor 2 weekA0.17±0.280.22±0.350.17±0.28B2.06±0.831.78±0.831)1.78±0.581)C2.33±0.471.67±0.371.67±0.63D2.34±0.561.56±0.541.19±0.392)E2.39±0.441.67±0.601.57±0.28F2.28±0.531.50±0.621.17±0.382)

Note：A.Control group;B.Model group;C.High-dose Shenling Baizhu San;D.Middle-dose Shenling Baizhu San;E.Low-dose Shenling Baizhu San;F.Mesalazine group.Compared with the control group,1)P<0.01;compared with the model group,2)P<0.05.

圖2 各組小鼠結腸單位長度與重量

圖3 各組小鼠結腸組織學變化(HE，×100)

圖4 各組小鼠血清中TNF-α、MIF、IL-10、EGF的水平

圖5 各組小鼠結腸NF-κB表達(DAB，×400)

圖6 各組小鼠結腸TLR4表達(DAB，×400)

2.5參苓白術散對UC小鼠結腸組織中NF-κB和TLR4表達的影響 與空白組相比，模型組胞質(zhì)胞核可見棕黃色和褐色顆粒均有增加；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術散低、中、高劑量組胞質(zhì)胞核內(nèi)棕黃色和褐色顆粒均有明顯減少；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術散低、中、高劑量組 NF-κB 表達明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，美沙拉嗪組和參苓白術散中、高劑量組 TLR4 表達顯著減少(P<0.01)，參苓白術散低劑量組TLR4表達下調(diào)(P<0.05)。見圖5、6。

3 討論

潰瘍性結腸炎(UC)在歐美發(fā)達地區(qū)發(fā)病率較高，在我國近年來發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。據(jù)報道，我國UC的患病率為11.6/10萬[7]。目前，臨床上治療UC的藥物較多，但均表現(xiàn)出明顯的毒副作用，如5-氨基水楊酸可引起惡心、嘔吐、再生障礙性貧血、輕度急性胰腺炎等，糖皮質(zhì)激素可誘發(fā)股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松、感染等，免疫抑制劑具有肝毒性、胃腸道毒性、血小板數(shù)量下降、誘發(fā)腫瘤等，新型生物制劑(英夫利西單克隆抗體等)可導致藥物過敏、并發(fā)感染等[8]。而中藥通過其對機體的綜合調(diào)節(jié)，尤其是對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，在治療UC中發(fā)揮出獨特的優(yōu)勢。

正常情況下，腸道微生態(tài)對機體發(fā)揮多種重要的生理調(diào)節(jié)作用，其中來自菌體的抗原對廣泛分布于腸道的免疫細胞有一定的刺激作用，使后者產(chǎn)生一定種類和數(shù)量的細胞因子，包括促炎因子和抗炎因子，兩類因子保持著動態(tài)平衡對于維持腸道甚至全身的穩(wěn)態(tài)起著重要作用。 大量證據(jù)表明，UC 發(fā)病過程中，出現(xiàn)細胞因子平衡被打破的現(xiàn)象，通過調(diào)節(jié)使平衡恢復，將會使UC緩解或痊愈，因此，糾正失衡的細胞因子被認為是治療UC的重要手段[9]。

由腸黏膜固有層單核細胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)在UC患者以及UC模型小鼠中含量均顯著升高。TNF通過結合相應的受體TNFR1和TNFR2，激活胞內(nèi)NF-κB，誘導更多細胞因子的產(chǎn)生[10]。抗 TNF-α單抗(英夫利昔)于2005年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準進入臨床治療潰瘍性結腸炎，即充分顯示了良好的臨床有效性。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)由巨噬細胞及T細胞分泌，能夠抑制巨噬細胞游走，促進巨噬細胞在炎癥部位聚集，并進一步激活其他細胞因子的分泌，同時還能促進TLR4的表達[11]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體黃芩苷(Baicalin)能緩解大鼠UC，與其抑制MIF表達、下調(diào)巨噬細胞數(shù)量以及巨噬細胞相關細胞因子MCP-1、MIP-3α有關[12]。鑒于TNF與MIF在致UC過程中發(fā)揮重要作用，因此阻斷TNF或MIF能改善UC患者或UC動物模型的癥狀，因此，TNF或MIF被認為是治療UC的重要靶標。

IL-10是一種多源性細胞因子，在腸道主要由T細胞、B細胞和巨噬細胞等分泌，對TNF-α、IL-6和IL-1等其他促炎因子有抑制作用，是一種具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的抗炎細胞因子。全基因組關聯(lián)研究(GWAS)顯示，IL-10或IL-10R等位基因突變與UC發(fā)生存在很強關聯(lián)，提示IL-10在抗UC中的重要作用[13]。表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)可通過刺激細胞代謝和增生有助于潰瘍部位損傷的修復，也是抗UC的重要因子[14]。

本實驗結果顯示，一定劑量的參苓白術散治療能明顯改善UC小鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、DAI評分及結腸組織學病變，抑制促炎因子TNF-α和MIF表達，同時上調(diào)抗炎因子IL-10與EGF的表達，表明參苓白術散可以通過糾正上述細胞因子失衡而發(fā)揮治療UC的作用。

TLR4是TLRs家族中的重要成員，通過識別相應的PAMP，激活轉錄因子NF-κB。NF-κB被激活后，調(diào)控一系列免疫炎癥反應相關的基因轉錄。研究表明，UC時NF-κB高度活化，并引發(fā)相關炎癥因子的表達異常，導致促炎因子/抗炎因子平衡失調(diào)，從而引起腸道黏膜免疫炎癥性損傷[15]。TLR4在正常人體腸道黏膜中少量表達，但在 UC 患者或UC模型小鼠的腸黏膜中往往大量表達[16]。本實驗結果表明，在參苓白術散的干預下，TLR4與NF-κB出現(xiàn)明顯的下調(diào)。因此，我們推測參苓白術散對上述細胞因子失衡的糾正可能與調(diào)整TLR4/NF-κB信號通路有關。

參苓白術散是復方中藥，成分復雜，其確切的抗UC組分及詳細的作用機制尚有待于進一步研究，這些問題的闡明將為其開發(fā)成為潛在的抗UC藥物奠定堅實的基礎。