盛 蒙 許 滔 于紅紅 趙立鳳 俞 琦 田維毅 (貴州中醫(yī)藥大學,貴陽 550002)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈血管管壁的慢性炎癥性疾病，動脈內(nèi)脂質(zhì)和纖維結(jié)締組織積聚，伴有局部炎癥反應；同時，也是心血管疾病的病理基礎，可引起多種疾病，如冠心病，中風等[1]。隨著心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，死亡率也隨之提高，AS防治問題顯得至關(guān)重要。巨噬細胞作為一種固有免疫細胞，參與炎癥反應的全過程，在AS形成的脂質(zhì)期到發(fā)展為斑塊，最后發(fā)展到斑塊破裂，都有巨噬細胞的全程參與[2]。AS斑塊中含有M1型和M2型兩種表型巨噬細胞，M1型巨噬細胞在疾病的發(fā)展中表達多種促炎介質(zhì)，比如：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等，起到促炎的作用；M2型在疾病的發(fā)展中主要分泌抗炎細胞因子，比如：轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、IL-1受體拮抗劑，并增加膠原的分泌，有利于維持斑塊的穩(wěn)定性，減少斑塊破裂引發(fā)的心血管疾病[3]。而PPAR-γ活化在巨噬細胞極化的過程中發(fā)揮重要的作用，表現(xiàn)在調(diào)節(jié)巨噬細胞脂質(zhì)代謝、抑制促炎基因和促進M2表型的轉(zhuǎn)化[4]。

黃連解毒湯出自《外臺秘要》，由黃連、黃柏、黃芩、梔子四味清熱解毒類藥物組成，具有清熱解毒瀉火之功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯具有抗炎、調(diào)脂、抗AS等藥理作用，中藥通過自身多靶點、多途徑的優(yōu)勢防治AS[5]。黃連解毒湯是否能通過激活PPARγ，促進ox-LDL誘導的RAW264.7源性泡沫細胞向M2表型極化，成為一個新的防治AS的作用機制，值得探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及細胞 雄性SD大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量200～220 g，許可證號SCXK(湘)2014-0011，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司。動物實驗由貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準進行，實驗符合動物倫理委員會規(guī)定，倫理委員會編號NO1503018。RAW264.7巨噬細胞購于上海中喬新舟有限公司，干細胞庫標號為ZQ 0098。

1.1.2藥物及試劑 黃連解毒湯按《外臺秘要》原方比例配伍(黃連9 g，黃柏6 g，黃芩6 g，梔子9 g)，飲片購自北京同仁堂貴陽店，并經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院王祥培教授鑒定為正品。按常規(guī)方法水煎煮制備水煎液，并將其加熱濃縮至含生藥量濃度為1 g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩MEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司，批號LOT NO：319005121)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：18050302)；Accutase細胞消化液(美國eBioscience公司，批號00-4555)臺盼藍染色液(北京索萊寶科技有限公司Lot No:20151026);CCK-8檢測試劑(東仁化學科技上海有限公司，批號Lot：NN710)；小鼠IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒[愛必信(上海)生物科技有限公司，批號分別為abs520001，abs520005]；小鼠TNF-α、TGF-β ELISA試劑盒(伊萊瑞特，批號分別為 E-EL-M0049c，E-EL-0162c)。BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司 批號：20180629)；抗體PPARγ、Arg-1(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號分別為：16001-1-AP，16643-1-AP)；油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1262)；ox-LDL(Yiyuan Biotechnology Lot No:2019-04-10)；IL-4(美國PeproTech公司 Lot:#021749)；GW9662(MCE公司，Cat No:HY-16578)；CD206抗體(英國Abcam 公司 LOT：GR322075-6)。

1.1.3儀器 CLASS100型CO2培養(yǎng)箱，MK3型酶標儀(美國Thermo公司)，NU-440-400E生物安全柜(美國Nuair公司)；3-18K型低溫離心機(德國Sigma公司)；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；流式細胞儀(BD公司)。

1.2方法

1.2.1黃連解毒湯含藥血清制備 取30只SD大鼠隨機分為3組，分別為黃連解毒湯高、低劑量組及正常組。將大鼠適應性喂養(yǎng)3 d，參照大鼠與人等劑量換算公式，以標準質(zhì)量/人的體重×6.3為標準，作為高劑量，稀釋1倍為低劑量，黃連解毒湯高、低劑量分別按6.3、3.15 g/(kg·d)灌胃，給藥體積為1 ml/100 g。正常組每天等劑量生理鹽水灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后股動脈取血，收集于離心管中，室溫靜置4 h，3 000 r/min離心10 min，制備各組血清，56℃水浴鍋滅活補體，0.22 μm 微孔濾膜過濾，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RAW264.7巨噬細胞的培養(yǎng) 將RAW264.7細胞復蘇后，用含有10%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫孵育。細胞聚合度達80%～90%用胰酶消化液按1∶3進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3細胞分組及干預 將RAW264.7細胞隨機分為6組，分別為正常血清組、模型組、黃連解毒湯高劑量組、黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯高劑量含藥血清+PPARγ抑制劑(GW9662)、黃連解毒湯低劑量含藥血清+PPARγ抑制劑(GW9662)。除正常組外，其余各組均用ox-LDL建立泡沫細胞模型。當RAW264.7細胞匯合度達到80%左右時，在每孔中加入80 mg/L的ox-LDL于培養(yǎng)箱中孵育3 h，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.4油紅O染色鑒定泡沫細胞 用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×105個/ml，種于24孔板中，每孔500 μl細胞懸液，實驗分為3組，即3 h、12 h造模后泡沫細胞組，正常組，置于37℃、5%CO2恒溫箱中分別孵育3 h、12 h。取出后，PBS沖洗3次，加入固定液固定30 min；清洗2次后，60%異丙醇浸洗5 min；加入配置好的染色液，浸染15 min，水洗2～5次；加入蘇木素染液，復染核1～2 min，洗去染料；在光學顯微鏡下觀察細胞泡沫化程度并拍照。

1.2.5CCK-8檢測泡沫細胞增殖情況 取生長至滿足條件的細胞(聚合度到80%)，胰蛋白酶消化并離心后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為8×103個/ml,按照正常血清組、黃連解毒湯含藥血清高劑量組分別加入5%、10%、20%、30%、40%、50%質(zhì)量分數(shù)的正常血清和含藥血清于96孔板中，每孔100 μl細胞懸液，全部加樣均設6個復孔。置于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，用酶標儀檢測450 nm光密度值時各組吸光度A。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測CD206陽性細胞數(shù)量 實驗分組參照1.2.3，細胞用胰酶消化液消化后，預冷的PBS沖洗3次，調(diào)整細胞至1×106個/100 μl于Ep管中。加入CD206抗體，4℃避光孵育30 min，1 ml PBS沖洗1次流式細胞儀檢測，以Flowjo分析結(jié)果。

1.2.7ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β的含量 將各組RAW264.7細胞以6×106個/ml密度接種于96孔板中，每孔加入100 μl細胞懸液，泡沫細胞誘導模型成功后，正常組及模型組按20%濃度正常血清孵育24 h；黃連解毒湯高、低、高+GW9662、低+GW9662劑量組分別加入含藥血清孵育24 h。收集各組細胞上清，備測。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β各自的表達。

1.2.8蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測PPARγ、Arg-1蛋白的表達 按照1.2.3的細胞培養(yǎng)方法，24 h后分別收集各組細胞，在細胞沉淀中加入含1%PMSF的細胞裂解液裂解細胞蛋白，收集上清，取4 μl稀釋后樣品用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，得出標準品和樣品吸光值，繪制標準曲線，計算蛋白樣品原濃度，配平后加入上樣緩沖液，100℃滅活10 min，并放置于-80℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE凝膠進行電泳，分離后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入目的蛋白對應的特異性抗體β-actin(1∶500)，PPARγ(1∶1 000)，Arg-1(1∶1 000)，4℃過夜，搖床洗膜5 min/次，共3次，加入相應的二抗(1∶5 000)室溫避光孵育 1 h。洗滌后，配置化學發(fā)光液，顯影，曝光采圖保存，Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1油紅O染色鑒定泡沫細胞 未經(jīng)ox-LDL誘導的RAW264.7巨噬細胞內(nèi)無明顯標記紅色脂滴的泡沫細胞；經(jīng)ox-LDL誘導3 h的巨噬細胞細胞質(zhì)內(nèi)可見部分紅色脂滴泡沫細胞；經(jīng)ox-LDL誘導12 h后，細胞質(zhì)內(nèi)可見明顯紅色脂滴呈現(xiàn)泡沫細胞形態(tài)。見圖1。

2.2對RAW264.7源性泡沫細胞增殖的影響 正常血清組隨血清濃度的增加未出現(xiàn)明顯差異。與正常血清組比較，黃連解毒湯含藥血清高劑量組在濃度5%、10%、20%、30%時，其泡沫細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義(表1，P<0.05)。根據(jù)實驗結(jié)果，可以選擇30%濃度以下的含藥血清進行后續(xù)實驗，文獻常用含藥血清濃度為20%，因此,后續(xù)實驗均采用20%的血清濃度，完成相關(guān)指標檢測。

圖1 RAW264.7巨噬細胞和泡沫細胞形態(tài)(油紅O，×200)

GroupsDose(g/kg)5%10%20%30%40%50%Normal-0.83±0.460.83±0.460.78±0.890.82±0.200.79±0.050.76±0.04HLJDT6.31.68±0.091.68±0.091.61±0.071.69±0.031.3±0.041)1.27±0.111)

Note:Compared with the normal group,1)P<0.05;HLJDT.Huanglianjiedu Decoction.

2.3對CD206陽性細胞的數(shù)量的誘導 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：用IL-4誘導RAW264.7巨噬細胞，作為對照組；與模型組相比，黃連解毒湯含藥血清高、低劑量組干預后能使CD206陽性細胞數(shù)量增高。見圖2、3。

2.4對泡沫細胞IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β含量的影響 與正常組比較，模型組用ox-LDL誘導RAW264.7源性泡沫細胞后IL-1β、TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.01)；IL-10、TGF-β的表達水平顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清高、低劑量組干預后能使IL-1β、TNF-α的表達下調(diào)(P<0.05，P<0.01)；IL-10、TGF-β的表達增強(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.5對泡沫細胞PPARγ、Arg-1蛋白表達的影響 與正常組相比，模型組用ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞后， PPARγ、 Arg- 1的蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，黃連解毒湯各劑量含藥血清干預后能明顯升高PPARγ、Arg-1的蛋白表達水平(P<0.05，P<0.01)。見圖4，表3。

圖3 不同濃度黃連解毒湯含藥血清對CD206陽性細胞數(shù)量的影響

圖2 不同濃度黃連解毒湯含藥血清對CD206陽性細胞數(shù)量的流式細胞圖

GroupsIL-1βTNF-αIL-10TGF-βNormal7.68±2.1114.48±3.3148.63±2.2620.26±0.30Model54.75±1.321)24.22±4.321)34.68±1.701)17.67±0.271)High(6.3 g/kg)20.26±1.251)3)17.31±4.742)42.83±0.981)2)18.72±0.151)3)Low(3.15 g/kg)23.68±1.031)3)24.54±1.441)37.68±1.341)18.20±0.101)2)High+GW966251.33±1.791)25.79±1.091)34.68±2.951)17.49±0.251)Low+GW966253.24±1.441)28.31±1.961)32.10±4.641)16.67±0.141)2)

Note:Compared with the normal group,1)P<0.01;compared with the model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖4 泡沫細胞PPARγ、Arg-1蛋白表達電泳

GroupsDose(g/kg)PPARγArg-1Model-0.09±0.021)0.12±0.021)Normal-0.54±0.060.73±0.04High6.30.32±0.063)0.51±0.053)Low3.150.22±0.033)0.21±0.032)High+GW96626.30.26±0.023)0.16±0.043)Low+GW96623.150.13±0.040.33±0.23

Note:Compared with the normal group,1)P<0.01;compared with the model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

3 討論

在AS的形成與發(fā)展的過程中，低密度脂蛋白進入動脈血管壁之間，完成膽固醇堆積，使得血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細胞分泌激素促進單核細胞分化為巨噬細胞吞噬膽固醇及脂肪，產(chǎn)生泡沫細胞。巨噬細胞參與了AS發(fā)展的全過程。因此，炎癥與動脈粥樣硬化之前存在一定的聯(lián)系，控制炎癥有助于靶向治療動脈粥樣硬化[6]。PPARs是一種脂質(zhì)活化的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)和脂蛋白代謝[7]。作為它的亞型，PPAR-γ可通過抑制活化單核細胞產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α、IL-6等，減少單核細胞趨化蛋白的轉(zhuǎn)錄，從而減少單核細胞的聚集，有利于抑制AS的炎癥反應。其中包括抑制TNF-α表達，抑制TNF-α誘導的VCAM-1和MCP-1的表達[8]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在AS的斑塊形成中巨噬細胞存在兩種表型，分別為M1型、M2型。M1型巨噬細胞在疾病的發(fā)展中表達多種促炎介質(zhì)，不利于斑塊的穩(wěn)定，而M2型巨噬細胞在疾病的發(fā)展中主要分泌抗炎細胞因子，在斑塊的穩(wěn)定區(qū)域和未病變的區(qū)域表達豐富[9]。而PPARγ在調(diào)節(jié)巨噬細胞脂質(zhì)代謝、抑制促炎基因和促進M2型巨噬細胞的極化起到重要的作用。實驗結(jié)果證明，PPARγ被抑制可能對M2型巨噬細胞的極化產(chǎn)生負面影響，PPARγ的表達或者活性激活為巨噬細胞調(diào)節(jié)炎性的細胞因子提供了一種有效的手段[10]。

本研究結(jié)果表明，黃連解毒湯能抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞的炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達，并能上調(diào)含藥血清各組劑量IL-10、TGF-β的表達。結(jié)合相關(guān)文獻，黃連解毒湯可以抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞IL-1β的表達[11,12]。IL-1β、TNF-α均是M1表型巨噬細胞的標志物，說明黃連解毒湯能夠抑制炎癥，而CD206、Arg-1、IL-10、TGF-β均是M2表型巨噬細胞的標志物[13]，在采用黃連解毒含藥血清干預后，均能上調(diào)表達，PPARγ的表達量上調(diào)；黃連解毒湯含藥血清中加入抑制劑GW9662后，CD206、Arg-1、IL-10、TGF-β、PPARγ表達量都較單純的含藥血清組下降，說明黃連解毒湯能夠通過活化PPARγ來促進巨噬細胞向M2表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，巨噬細胞具有異質(zhì)性，在體內(nèi)可能因為復雜的微環(huán)境而表現(xiàn)出獨特的表型與功能。而我們可以通過中藥的調(diào)控，改善人體的微環(huán)境，通過黃連解毒湯活化PPARγ這個關(guān)鍵蛋白，使得巨噬細胞向M2表型分化而發(fā)揮抗炎的作用，減輕M1表型巨噬細胞的致炎反應[14,15]。本研究證明黃連解毒湯可通過活化PPARγ促進ox-LDL誘導的RAW264.7源性泡沫細胞向M2表型極化，為黃連解毒湯的抗AS機制研究在細胞水平上提供新的理論依據(jù)；為通過中藥作用于PPARγ誘導巨噬細胞極化發(fā)揮抗炎作用，找出基于PPARγ防治AS的機制，可能會成為治療AS的新靶點。