張 沛 盧寶全 楊 潔 (唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，唐山 063000)

腦梗死又稱為缺血性卒中，是由于各種原因引起的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，從而產(chǎn)生腦組織缺血、缺氧性壞死，并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀[1]。臨床上，將腦梗死根據(jù)其發(fā)病分為腦血栓形成、腔隙性腦梗死、腦栓塞三種，而腦血栓形成占全部腦梗死的60.0%[2]。研究表明：動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)生腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其次為高血壓、吸煙、飲食不當(dāng)及缺乏鍛煉等，且多數(shù)因素為可控因素[3]。神經(jīng)干細(xì)胞屬于是一種未分化的原始神經(jīng)細(xì)胞，體外具有多向分化潛能，能促進(jìn)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)的再生與組織修復(fù)。但是，人體中神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較少、分布有限，難以滿足臨床需要[4]。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是由中胚層發(fā)育形成的多能干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織器官中(骨髓組織中最為豐富)，能在不同微環(huán)境下向纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等細(xì)胞分化，能為神經(jīng)干細(xì)胞替代治療提供前提[5]。

腦梗死屬于中醫(yī)“中風(fēng)”、“類中”范疇，好發(fā)于我國(guó)中老年人群中，具有發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)[6]?！秲?nèi)經(jīng)》[7]中記載，腦梗死屬于“中風(fēng)”范疇，多由于憂思傷脾、暴怒傷肝、房勞過(guò)度或外感六淫等引起，導(dǎo)致肌膚筋脈失于潤(rùn)樣，造成機(jī)體陰陽(yáng)失衡，引起腦脈痹阻，形成上實(shí)下虛，陰陽(yáng)互不維系。甘草屬于多年生草本豆科植物，以根與根莖入藥，富含三萜皂苷、異甘草素[8,9]。異甘草素屬于甘草中異黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用，能擴(kuò)張動(dòng)脈，對(duì)心臟、大腦均具有良好的保護(hù)作用[10]。但是，異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腦梗死大鼠中的機(jī)制研究較少。因此，本文探討異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腦梗死大鼠中的保護(hù)作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年5月～2018年11月購(gòu)置SD大鼠100只，10只用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、制備；剩余90只SD大鼠采用線栓法完成急性腦梗死大鼠模型，隨機(jī)分為異甘草素組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、聯(lián)合干預(yù)組，每組30只。100只SD大鼠，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量215～238 g，平均(233.00±12.00)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXX-2016-0021，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食[11]。

1.1.2儀器與設(shè)備 高度冷凍離心機(jī)(型號(hào)5910型)(日本久保田)，IMDM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，超凈工作臺(tái)(德國(guó)Leica公司)，數(shù)字顯微照相機(jī)(型號(hào)BX43)(奧林巴斯)，胎牛血清(上海寶曼生物科技有限公司)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Santa Cruz公司)，注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠)、病理組織切片機(jī)(美國(guó)，AO，820 )，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó) HAR 公司)，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，異甘草素(南京春秋生物工程有限公司)，氯胺酮(昆明積大制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H200804952)。

1.2方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng) ①細(xì)胞分離、培養(yǎng)。采用密度梯度離心聯(lián)合骨髓貼壁法完成BMSCs分離、培養(yǎng)。取10只SD大鼠，給予靜脈全麻，待麻醉生效后常規(guī)消毒、鋪巾，在右側(cè)髂嵴部位常規(guī)備皮。利用吸管吸取預(yù)先稀釋好的肝素0.5 ml，將骨穿刺針垂直于髂嵴穿刺點(diǎn)，并沿著髂骨中層進(jìn)入髓腔。滿意后拔出針芯，連接注射器，快速抽取骨髓液2.0～3.0 ml。向骨髓液中等比例加入PBS，參考1∶1比例充分混合均勻后加入Percoll分離液，密度1.073 g/ml，離心35 min，離心力3 225 g，離心半徑40 cm。利用吸管吸取離心管中乳白色界面層(單核細(xì)胞)將其轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管，利用PBS連續(xù)完成3次清洗，利用DMEM培養(yǎng)基(含有胎牛血清10.0%)5 ml完成細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)，接種在塑料培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，48 h后首次換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，待細(xì)胞融合瓶底80%以上后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞，備用，完成細(xì)胞鑒定[12]。②細(xì)胞鑒定。取第4天生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，在倒置顯微鏡下觀察單個(gè)細(xì)胞基因形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD44，完成細(xì)胞鑒定[13]。

1.2.2模型建立及處理 ①模型建立。90只SD大鼠采用線栓法完成急性腦梗死模型。建模前禁食、禁飲4 h，根據(jù)無(wú)菌原則進(jìn)行操作，腹腔注射2.5%氯胺酮20 mg/kg麻醉，10 min后固定。取俯臥位姿勢(shì)，于頸正中做手術(shù)切口，充分游離右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈。分離迷走神經(jīng)、迷走神經(jīng)節(jié)，完成頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈結(jié)扎，在頸總動(dòng)脈分叉5 mm 部位做手術(shù)切口，利用明膠處理的1.8號(hào)魚線經(jīng)切口插入右頸內(nèi)動(dòng)脈，深度17.0～18.0 mm。栓線頭端達(dá)到大腦前動(dòng)脈與大腦中動(dòng)脈分叉部位，完成頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎，實(shí)現(xiàn)血供的完全阻斷，2 h后將栓線輕輕拔出10 mm，形成血流再灌注，根據(jù)大鼠行為學(xué)異常、病理組織檢查判定建模成功[14]。②動(dòng)物的處理。異甘草素組注射異甘草素30 mg/kg，腹腔注射;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組注射2.0×109L-1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1 ml，每天2次；聯(lián)合干預(yù)組在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)上給予異甘草素9 g/kg(相當(dāng)于成人劑量20倍)，配置水溶液，灌胃，4周干預(yù)后對(duì)各組干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)估[15]。

1.2.3觀察指標(biāo) ①神經(jīng)功能評(píng)分。采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)對(duì)各組干預(yù)后1、2、3及4周神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，每周每組隨機(jī)取5只(評(píng)分完畢后放回籠中，不處死)，量表總分45分，分值越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重[16]。②HE染色結(jié)果。三組4周干預(yù)后每組取大鼠5只，以斷頸方式處死，取腦部病灶組織，制備4 μm切片，經(jīng)無(wú)水乙醇梯度處理后給予蘇木精染色15～20 min，倒置顯微鏡下觀察各組腦部組織情況[17]。③腦梗死體積。各組干預(yù)后1、2、3、4周分別取SD大鼠(每組每周取大鼠5只，每組合計(jì)20只)，采用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積。以斷頸方式處死大鼠，取腦部組織，作冠狀位切片2 μm，利用TTC(濃度2%)完成 30 min 染色，正常組織為紅色，梗死病灶為白色。梗死體積=梗死面積×切片厚度[18]。④炎癥因子水平。三組干預(yù)前、干預(yù)后取各組大鼠5只(每組剩余的存活大鼠)，取頸動(dòng)脈血3 ml，血清分離后采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)測(cè)定大鼠TNF-α、IL-10及IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、鑒定 分離培養(yǎng)3 d 可見(jiàn)細(xì)胞形成多個(gè)集落，且多呈多角形、長(zhǎng)梭形，具有明顯的集落生成；傳代3次后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨于一致，胞體飽滿，具有良好的一致性，純度> 97.0%，見(jiàn)圖1。

細(xì)胞表面標(biāo)記物結(jié)果表明： CD34染色<5%，而CD29、CD44染色陽(yáng)性率>90%，制備的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

圖2 熒光顯微鏡及細(xì)胞表面標(biāo)記物測(cè)定

2.2各組神經(jīng)功能評(píng)分比較 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組干預(yù)后1、2、3、4周神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后1、2、3、4周NIHSS評(píng)分，均低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、異甘草素組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3各組HE染色結(jié)果比較 HE染色下異甘草素組未建立模型，腦部區(qū)域無(wú)明顯變化；異甘草素大鼠HE染色下可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞萎縮、壞死，核仁消失；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦梗死細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐富，能明顯可見(jiàn)壞死細(xì)胞；聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)少許壞死細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

2.4各組腦梗死體積比較 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組干預(yù)后1、2、3、4周腦梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后1、2、3、4周腦梗死體積,均低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖4。

2.5各組炎癥因子比較 三組干預(yù)前各炎癥因子比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組干預(yù)后4周TNF-α及IL-1β水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后4周TNF-α及IL-1β水平，低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)；聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后4周IL-10水平，高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖3 三組HE染色結(jié)果比較(×200)

GroupsAfter the intervention1 week2 weeks3 weeks4 weeksCombined intervention group24.41±2.591)2)18.34±2.311)2)15.31±2.291)2)11.12±2.151)2)BMSCs group30.59±3.4027.41±3.2523.59±3.1618.83±2.69Isoliquiritigenin group31.32±3.2530.98±3.2229.57±3.2129.09±3.16

Note：Compared with isoliquiritigenin group,1)P<0.05;compared with BMSCs group,2)P<0.05.

GroupsAfter the intervention1 week2 weeks3 weeks4 weeksCombined intervention group56.12±4.981)2)43.31±4.511)2)28.56±3.591)2)18.42±2.091)2)BMSCs group64.25±5.1558.42±4.9343.69±4.5236.31±3.59Isoliquiritigenin group67.56±5.2166.49±5.1566.12±5.0965.98±5.03

Note：Compared with isoliquiritigenin group,1)P<0.05;compared with BMSCs group,2)P<0.05.

GroupsTNF-α(ng/L)Beforeintervention4 weeks afterthe interventionIL-10(pg/ml)Beforeintervention4 weeks afterthe interventionIL-1β(ng/L)Beforeintervention4 weeks afterthe interventionCombined intervention group27.49±4.5112.49±2.311)2)3)13.49±3.4117.48±2.351)2)7.39±1.213.45±0.621)2)BMSCs group27.50±4.5220.41±3.493)13.40±3.4314.59±2.533)7.40±1.224.69±0.913)Isoliquiritigenin group27.53±4.5520.11±3.433)13.44±3.4214.98±2.573)7.41±1.234.70±0.923)

Note：Compared with isoliquiritigenin group,1)P<0.05;compared with BMSCs group,2)P<0.05;compared with before intervention,3)P<0.05.

圖4 三組梗死體積圖片

3 討論

腦梗死是臨床上常見(jiàn)的疾病，成為世界范圍內(nèi)致殘、死亡的主要原因，影響我國(guó)居民健康、生活[19]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明：我國(guó)每年由于腦梗死死亡病例超過(guò)100萬(wàn)，占我國(guó)所有死亡病因的2.45%，且存活患者中約有50.0%～70.0%伴有癱瘓、失語(yǔ)等[20]。目前，臨床上腦梗死治療方法包括：抗凝治療、溶栓治療、清除自由基、改善局部腦循環(huán)等，雖然能延緩病情發(fā)展，但是僅小部分病例受益，遠(yuǎn)期死亡率較高[21]。本研究中，以大鼠作為對(duì)象，構(gòu)建腦梗死大鼠動(dòng)物模型，并給予異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)，結(jié)果表明：聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后1、2、3、4周NIHSS評(píng)分，均低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、異甘草素組(P<0.05)，說(shuō)明異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能，利于大鼠恢復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是21世紀(jì)干細(xì)胞工程研究熱點(diǎn)，亦是最有前途的組織工程種子細(xì)胞[22]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦梗死中能減少梗死面積，改善神經(jīng)功能，并且干細(xì)胞能釋放或刺激腦內(nèi)神經(jīng)元釋放大量的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)因子，均能改善腦梗死區(qū)域內(nèi)環(huán)境，減少梗死邊界區(qū)細(xì)胞凋亡的數(shù)量，均能減輕炎癥反應(yīng)[23]。國(guó)外學(xué)者研究表明：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能提高星形膠質(zhì)細(xì)胞存活，促進(jìn)內(nèi)生性細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步促進(jìn)新生血管的形成[24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能減少腦梗死病灶面積，改善動(dòng)物的行為學(xué)，進(jìn)一步刺激壞死周圍神經(jīng)環(huán)路的形成。本研究中，聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后1、2、3、4周后腦梗死體積,均低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)，與既往研究相符。

異甘草素屬于是黃酮類化合物，多為黃色針狀結(jié)晶，難溶于水，廣泛存在于豆類植物甘草中。隨著工業(yè)化提取、藥理試驗(yàn)及毒性試驗(yàn)的廣泛發(fā)展，使得異甘草素研究新藥成為可能[25]。異甘草素用于腦梗死大鼠中，能發(fā)揮抗氧化、抗原作用，具體機(jī)制如下：①異甘草素的IC50為55.8 mmol/L，對(duì)于酶的抑制作用屬于混合型，用于腦梗死大鼠中能清除機(jī)體內(nèi)的自由基，發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用[26]。②抗炎作用。異甘草素屬于是一種醛糖還原酶抑制劑，能抑制環(huán)氧合酶、脂氧合酶活性，從而能發(fā)揮抗血小板凝聚作用，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[27,28]。同時(shí)，異甘草素亦可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，能組織Iκ-B活性，調(diào)節(jié)TNF-α活性，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧的生成，從而發(fā)揮抗炎作用[29,30]。本研究中，首次將異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦梗死大鼠中，并完成HE染色，結(jié)果表明：HE染色下空白對(duì)照組未建立模型，腦部區(qū)域無(wú)明顯變化；空白對(duì)照大鼠HE染色下可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞萎縮、壞死，核仁消失；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦梗死細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐富，能明顯可見(jiàn)壞死細(xì)胞；聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)少許壞死細(xì)胞;聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后4周TNF-α及IL-1β水平，低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)。聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后4周IL-10水平，高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組與異甘草素組(P<0.05)，說(shuō)明異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦梗死大鼠中能緩解大鼠癥狀，延緩神經(jīng)組織損傷，有助于降低死亡率。同時(shí)，甘草素的使用能降低干細(xì)胞昂貴的培養(yǎng)費(fèi)用，能減少干細(xì)胞的使用，可為臨床腦梗死治療提供方法。

綜上所述，異甘草素聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于腦梗死大鼠中有助于改善神經(jīng)功能，減少腦梗死面積，能為腦梗死治療提供思路與方法。