金炳熔 車 楠 李良昌 李 莉 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，延吉 133002)

哮喘是一種涉及免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素的慢性肺部疾病，已成為全球兒童和成人臨床醫(yī)學(xué)中最常見的疾病之一[1]。哮喘的特點是氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness,AHR)和可逆性氣流阻塞。氣道炎癥通常由免疫細胞過度活化引起，以嗜酸性粒細胞增多、杯狀細胞增生、黏液分泌為特征。氣道炎癥過程中，活化的炎癥細胞分泌細胞毒性介質(zhì)導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生。當(dāng)機體內(nèi)ROS水平過高時可誘發(fā)氣道氧化應(yīng)激，無差別損傷細胞內(nèi)功能生物分子并調(diào)控細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒、氣道重塑和黏液分泌促進氣道損傷，導(dǎo)致哮喘進一步加重[2]。因此，抑制ROS可能是哮喘的潛在治療靶點。番茄紅素(Lycopene,LYC)廣泛存在于自然界的各種水果和植物中，具有免疫調(diào)節(jié)作用并能夠通過抑制氧化應(yīng)激在LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷中發(fā)揮抗炎作用[3，4]。目前，番茄紅素對哮喘的作用及機制尚未有明確研究。因此，本研究以卵清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型，并給予番茄紅素治療，探討番茄紅素對哮喘的作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料 番茄紅素、OVA(美國Sigma公司)；活性氧檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(碧云天)；IL-4、IL-5和IL-13 ELISA試劑盒、IL-5(MM550CB)和IL-13(M130B)抗體(美國Invitrogen公司)；IL-4(12227)、p-PI3K(4228)、PI3K(4255)、p-AKT(9275)、AKT(9272)，p-NF-κB p65(3033)、NF-κB p65(6956)和β-actin(4970)抗體(美國Cell Signaling公司)；402型霧化器(四菱醫(yī)療器械廠)；氣壓體積描記室(韓國All Medicus公司)；酶標(biāo)儀(Bio Rad，美國)；流式細胞儀(美國貝克曼公司)；電泳儀及電泳槽(美國Bio Rad公司)；Cytation5多功能成像(美國Bio Tek公司)；Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)(美國GE Healthcare)。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立與分組 小鼠隨機分為對照組(control)、模型組(model)、番茄紅素低劑量組(LYC 50 mg/kg)和番茄紅素高劑量組(LYC 100 mg/kg)。模型組、番茄紅素組小鼠于第1、7、14天腹腔注射OVA(10 μg)+氫氧化鋁(1 mg)的生理鹽水混合液200 μl，對照組注射等量生理鹽水。第21天將致敏小鼠置于玻璃罩內(nèi)，每組以O(shè)VA(0.1 g)生理鹽水混合液10 ml霧化吸入30 min，1次/d，共7 d。治療組在激發(fā)前分別灌服番茄紅素50 mg/kg或100 mg/kg，共計7 d。

1.2.2實驗樣本獲取與處理 將小鼠于末次激發(fā)48 h后麻醉致死，以1 ml生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，收集BALF，血球計數(shù)儀計細胞總數(shù)。剩余BALF在4℃，1 000 r/min離心5 min，取上清液，-80℃保存，待測細胞因子。離心沉淀涂片后Diff-quik染色，進行細胞分類計數(shù)。取右肺下葉，10%(v/v)甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，HE染色觀察肺部炎癥情況。其余各肺葉放入液氮中速凍，-80℃保存待用。

1.2.3BALF中細胞因子IL-4、IL-5和IL-13含量的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，具體操作按試劑盒說明書進行，結(jié)果單位以pg/L表示。

1.2.4BALF和肺組織中ROS的檢測 BALF離心涂片，500 mg右肺組織樣品制備勻漿(10%，w/v)，按照說明書裝載DCFH-DA探針，cytation5成像系統(tǒng)或流式細胞儀488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長條件下進行檢測。

1.2.5ROS、MDA和SOD的檢測 取500 mg右肺組織樣品制備勻漿(10%，w/v)。根據(jù)試劑盒說明書進行操作，測定ROS、MDA水平以及SOD活性。

1.2.6Western blot分析 肺組織制備勻漿，裂解后獲取蛋白，BCA方法測定蛋白濃度，每泳道加入20 μg 樣本，進行電泳及轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉TBS-T緩沖液孵育封閉膜上非特異性位點，按照抗體比例進行稀釋后孵育2 h。洗膜后再用HRP標(biāo)記的二抗雜交，室溫孵育2 h。清洗后加入ECL發(fā)光試劑，利用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)成像并分析。

1.2.7氣道高反應(yīng)性(AHR)檢測 最后一次OVA激發(fā)后48 h，將清醒的大鼠置于體描室，記錄3 min內(nèi)平均基線讀數(shù)，采用乙酰甲膽堿(從2.5至50 mg/ml)進行霧化3 min，記錄平均讀數(shù)。根據(jù)制造商的方案計算增強呼氣間歇(Penh)，作為氣道縮窄指數(shù)來反映氣道高反應(yīng)的程度。

2 結(jié)果

2.1番茄紅素對哮喘小鼠BALF中細胞總數(shù)及各分類細胞數(shù)的影響 如表1所示，模型組小鼠BALF中細胞總數(shù)明顯高于對照組，且嗜酸性粒細胞，中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)；番茄紅素灌胃治療后，哮喘小鼠BALF中各項指標(biāo)明顯下降(P<0.05)。

2.2番茄紅素對哮喘小鼠肺部炎癥的影響 觀察哮喘小鼠肺部炎癥變化，HE染色結(jié)果顯示，模型組存在明顯的氣道平滑肌增厚，黏液分泌過多以及大量的炎性細胞浸潤。而番茄紅素治療組小鼠肺組織氣道上皮無明顯增厚，肺泡壁較完整，炎性細胞明顯減少。

GroupsTotal cells(×104/ml)Lymphocytes(×104/ml)Neutrophils(×104/ml)Eosinophils(×104/ml)Control8.35±0.970.37±0.080.54±0.061.06±0.20Model24.88±3.011)3.45±0.841)2.07±0.411)13.42±2.461)LYC 50 mg/kg18.26±2.832)2.69±0.122)1.48±0.222)9.27±1.312)LYC 100 mg/kg12.44±1.072)1.97±0.262)1.06±0.092)6.55±0.722)

Note：Compare with control,1)P<0.05;compare with model,2)P<0.05.

2.3梓醇對BALF和肺組織中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響 如表2所示，ELISA結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯增高(P<0.05)；番茄紅素明顯降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平(P<0.05)。與Western blot結(jié)果一致(圖2)。

圖1 番茄紅素對哮喘小鼠肺部炎癥的影響(×200)

GroupsIL-4(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)Control76.51±10.0768.37±11.9652.24±9.33Model402.71±40.661)377.45±38.62195.76±32.981)LYC 50 mg/kg295.10±37.432)264.39±40.092)127.55±14.312)LYC 100 mg/kg147.39±19.642)128.92±20.062)84.18±10.882)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with model,2)P<0.05.

圖2 番茄紅素對哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5和IL-13表達的影響

2.4番茄紅素對哮喘小鼠AHR的影響 如圖3所示，與對照組相比，模型組小鼠氣道反應(yīng)明顯增高(P<0.05)；而番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)(均P<0.05)。

2.5番茄紅素對哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激的影響 如圖4所示，模型組小鼠肺部ROS和MDA水平明顯升高，而抗氧化酶SOD活性明顯下降(P<0.05)；番茄紅素能夠有效降低哮喘小鼠肺部ROS和MDA水平并提高SOD活性(P<0.05)。

2.6番茄紅素對PI3K/AKT/NF-κB信號通路的影響 如圖5所示，模型組p-PI3K、 p-AKT以及p-p65表達水平明顯升高(P<0.05)，而番茄紅素和NAC處理后，蛋白表達明顯降低(P<0.05)。

圖3 番茄紅素對哮喘小鼠AHR的影響

圖4 番茄紅素對哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激的影響

圖5 番茄紅素對PI3K/AKT/NF-κB的影響

3 討論

哮喘是一種復(fù)雜的臨床綜合征，以炎癥、氣道高反應(yīng)性和重塑為特征，與活性氧生成增加和抗氧化防御功能受損有關(guān)[5]，是全球范圍內(nèi)最常見的過敏性疾病之一。研究表明[6]，哮喘主要由適應(yīng)性免疫介導(dǎo)，其中Th2型細胞因子具有重要作用，Th2細胞遷移到氣道上皮細胞后分泌2型細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等，參與黏液分泌，氣道重塑和AHR。番茄紅素是一種重要的紅色非氧類胡蘿卜素，以往對其生物學(xué)功能的研究主要集中在抗氧化、降低心血管疾病的風(fēng)險、減少基因損傷和抑制腫瘤生長等[7]，而針對哮喘方面的作用尚未有明確報道。本研究實驗結(jié)果表明，番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠BALF中炎癥細胞浸潤，降低BALF和肺組織中IL-4、IL-5和IL-13水平，改善肺組織病理學(xué)，抑制氣道高反應(yīng)性，表明番茄紅素具有抗哮喘作用。

氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細胞內(nèi)重要生物分子和亞細胞結(jié)構(gòu)損傷的多種細胞通路的基礎(chǔ)，由ROS等多種活性物質(zhì)共同參與。ROS是一組不穩(wěn)定的、具有高度活性的分子或自由基，在免疫、細胞生長和細胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。哮喘進程中，氣道中浸潤炎癥細胞以及氣道結(jié)構(gòu)細胞會產(chǎn)生大量的ROS，高水平的ROS加劇了氣道對過敏原激發(fā)的反應(yīng)，并對氣道功能造成了許多不利影響，包括氣道平滑肌收縮，AHR誘導(dǎo)，黏液分泌過多，上皮脫落和血管滲出[8-10]。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是氧化應(yīng)激的一種生物標(biāo)志物，能夠提示細胞脂質(zhì)過氧化的水平。以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)為主的一線防御抗氧化劑能夠破壞超氧自由基，在機體抗氧化防御系統(tǒng)中是必不可少的。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素處理后，哮喘小鼠肺部ROS水平、MDA水平明顯下降，SOD活性明顯提高，表明番茄紅素處理后能夠明顯抑制哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激。

ROS是調(diào)節(jié)細胞活動的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，能夠參與多種細胞信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。Phospho-inositide 3-kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)信號通路是參與外部刺激反應(yīng)的重要細胞級聯(lián)。PI3K激活下游信號分子AKT，并在多種生物反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，包括炎癥、細胞增殖和細胞凋亡等[11]。研究表明，ROS能夠激活PI3K/AKT信號通路，促進轉(zhuǎn)錄因子，如核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)的激活[12]。NF-κB屬于誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，除了協(xié)調(diào)先天免疫細胞中各種促炎基因的誘導(dǎo)，NF-κB還能調(diào)節(jié)炎癥T細胞的活化、分化和效應(yīng)功能，誘導(dǎo)IL-4等促炎細胞因子表達[13,14]，導(dǎo)致氣道纖維化，平滑肌細胞增殖以及肺部黏液量增加，進一步加重哮喘。本研究結(jié)果表明，番茄紅素能夠抑制哮喘小鼠肺部p-PI3K、p-AKT以及p-p65表達。暗示番茄紅素可能通過調(diào)控ROS抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路。綜上所述，本研究表明，番茄紅素可能通過抑制ROS調(diào)控的PI3K/AKT/NF-κB通路發(fā)揮其抗哮喘作用。