喬高翔，楊麗聰，鄭國棟

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

菝葜（Smilax china L.）又名金剛刺，屬于多年生藤本落葉攀附植物[1]，一般生于海拔2000 米以下，常長在叢林、山谷、道路旁，由于生長環(huán)境不為嚴(yán)苛，在諸多地區(qū)極為多見。菝葜屬植物在全世界達(dá)300 多種[2]，在我國也有不少種屬和一些變種植物，分布于中國長江以南各地[3]。菝葜藥性平和，多作用于肝腎，有治療疲血、風(fēng)濕、痢疾等功效[4]，是中藥中使用的常見藥材，菝葜還有活血化瘀、治療跌打損傷，強(qiáng)壯筋骨的作用[5]，故民間常以菝葜作引用來釀酒。菝葜全身是寶，其根、莖、葉均有不同的藥理效用，新鮮菝葜葉還可用于治療燙傷、燒傷?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)了菝葜的抗腫瘤、預(yù)防風(fēng)濕的功能、對高血糖和炎癥也有緩解的功效[6]。

菝葜根莖含有多種對人體有益的化合物，它的成分包含甾體皂苷、酚類化合物、芪類等類型的化合物[7]。這些化合物都有很強(qiáng)的藥理性，被廣泛學(xué)者研究。其中甾體皂苷有很強(qiáng)的生理活性，皂甙是一類極性較強(qiáng)的大分子化合物，具有止血、抗腫瘤和調(diào)節(jié)心血管的作用[8]；酚類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化性，例如菝葜根莖里面所含的類黃酮色素，其內(nèi)所含有的黃酮醇有著較強(qiáng)的抗氧化性和抗還原性，在藥理學(xué)上對潰瘍、病毒、炎癥都有很強(qiáng)的抗性，也有解痙、降血脂和鎮(zhèn)痛的能力[9]；芪類化合物是指具有均二苯乙烯母核或其聚合物的一類物質(zhì)的總稱，當(dāng)受到病菌感染或其他外界刺激的時候，芪類化合物就會增多，它是植物的天然應(yīng)激產(chǎn)物，在藥理學(xué)上具有抗菌，治療高血脂癥的功效，還有保護(hù)肝臟，擴(kuò)張毛細(xì)血管和冠狀血管的作用[10]。

近年來，隨著人們生活條件的提高，對食品安全問題高度重視，天然色素走入大眾視野，隨之天然色素的染色著色，生理活性的開發(fā)與利用己成為各行業(yè)科技工作者普遍關(guān)注的課題[11]。因此，菝葜根莖提取出的天然色素具有廣闊的發(fā)展前景，對菝葜色素的研究目前集中在對菝葜組成成分的報道，而對其豐富的根莖色素資源卻極少見研究報道。本研究從菝葜根莖的色素入手，為開發(fā)利用菝葜屬種類這一豐富資源，增加其經(jīng)濟(jì)附加值、美化環(huán)境及尋找天然食品著色劑提供依據(jù)。

本試驗采用L9（33）正交表排列優(yōu)化進(jìn)行重復(fù)性驗證試驗，采用乙醇提取法對菝葜根莖色素進(jìn)行提取，把乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比及提取時間等作為測定因素，控制單一變量，探究其對菝葜根莖色素提取效果的影響，同時探究了氧化還原劑及金屬離子對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響[12]。為菝葜根莖色素穩(wěn)定性研究與開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菝葜根莖：南昌榮佳藥業(yè)。

95%乙醇、石油醚、H2O2和 Na2SO3、氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鋁、無水氯化鈣、三氯化鐵等金屬鹽（分析純）：南昌寶靈試劑公司。

1.2 儀器

SHMADZU-AUY120 電子分析天平：上海卓精電子科技有限公司；HH60 數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱：常州國華電器有限公司；V-5600 Spectrophotometer 紫外可見光譜儀：上海元析儀器有限公司。

1.2 菝葜色素提取工藝

1.2.1 提取試劑的選擇和確定

稱取3 份備用的菝葜根莖樣品，每份1 g，加入10 mL 的水、95%乙醇和石油醚，將管口封住，放在40 ℃下避光處水浴浸提0.5 h，冷卻到25 ℃后，對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，觀察色素液顏色并測定其在340 nm 處的吸光度值，以確定最合適的提取溶劑，每個試驗3 次重復(fù)。

1.2.2 確定最大吸收波長

稱取備用的菝葜根莖樣品1 g，與10 mL 95%乙醇溶液配制成料液比 1 ∶10（g/mL）的溶液，在 40 ℃下水浴浸提0.5 h，冷卻到25 ℃后對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，并用紫外可見光譜儀比較在320 nm～600 nm 波長范圍內(nèi)最大吸收波長處的吸光度值，每個試驗重復(fù)3 次。

1.2.3 菝葜色素提取條件單因素試驗

1.2.3.1 提取劑濃度對菝葜色素量的影響

稱取6 份菝葜根莖粉末，每份1 g，分別置于干凈的離心管中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、95%的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液10 mL，將管口封住，放在20 ℃下避光處水浴浸提0.5 h，冷卻到25 ℃后，對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，測定其在340 nm 處的吸光度值，以確定最合適的提取溶劑的濃度，每個試驗重復(fù)3 次。

1.2.3.2 提取溫度對菝葜色素量的影響

稱取6 份菝葜根莖粉末，每份1 g，分別置于干凈的離心管中，加入95%乙醇10 mL，將管口封住，分別放在不同溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）下避光處水浴浸提0.5 h，冷卻到25 ℃后，對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，測定其在340 nm處的吸光度值，確定最為合適的提取溫度，每個試驗重復(fù)3 次。

1.2.3.3 提取料液比對菝葜色素量的影響

稱取5 份菝葜根莖粉末，每份1 g，分別置于干凈的離心管中，分別加入 95%乙醇 10、15、20、25、30 mL，將管口封住，放在20 ℃下避光處水浴浸提0.5 h，冷卻到25 ℃后，對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，測定其在340 nm 處的吸光度值，確定最合適的提取料液比，每個試驗3 次重復(fù)。

1.2.3.4 提取時間對菝葜色素量的影響

稱取5 份菝葜根莖粉末，每份1 g，分別置于干凈的離心管中，分別加入95%乙醇10 mL，將管口封住，分別放在 20 ℃下避光處水浴浸提 0.5、1、1.5、2、2.5 h，冷卻到25 ℃后，對色素提取液進(jìn)行過濾操作處理，得到菝葜根莖色素的提取液，測定其在340 nm 處的吸光度值，確定最合適的提取時間，每個試驗3 次重復(fù)。

1.2.4 菝葜色素提取正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果進(jìn)行極差分析，選用提取溫度、提取時間、提取劑濃度作為正交試驗因素，通過比較吸光度值這個指標(biāo)來進(jìn)行評價，設(shè)計L9（33）正交試驗表，優(yōu)化改進(jìn)對菝葜根莖色素的提取工藝條件，其正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素和水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.3 菝葜根莖色素穩(wěn)定性測定試驗

選取正交試驗中溫度、時間、提取劑濃度的最優(yōu)結(jié)果，進(jìn)行提取一定量的菝葜根莖色素溶液，稀釋至所需濃度備用。

1.3.1 氧化劑和還原劑對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響

取8 份6 mL 的色素溶液于25 mL 離心管中，分別加入 0、1、2、3 mL 體積分?jǐn)?shù)為 30%的 H2O2溶液和 0、1、2、3 mL 濃度為 0.1 mol/L 的 Na2SO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，室溫25 ℃下放置24 h 后，測定其在340 nm 處的吸光度。

1.3.2 常見金屬離子對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響

取6 份5 mL 的色素溶液于10 mL 離心管中，分別加入 1 mL 的含有 Na+、K+、Al3+、Ca2+、Fe3+的溶液，另取一支加1 mL 蒸餾水，每支離心管均定容至10 mL，室溫25 ℃下放置24 h 后，分別觀察比較各試管現(xiàn)象并測定其在340 nm 處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的試驗數(shù)據(jù)平行3 次，結(jié)果表示為平均值±SD。數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行分析，然后用SPSS軟件版本21 進(jìn)行Duncan's 檢驗。顯著水平設(shè)置為p ＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇和確定

菝葜根莖色素在不同溶劑下提取效果的影響見表2。

表2 菝葜根莖色素提取試劑的選擇和確定Table 2 Selection and determination of rhizome pigment extraction reagent from Smilax china L.

由表2 可知，在其他條件相同的情況下，菝葜根莖色素在不同溶劑下提取效果的影響不同[13]，95%乙醇對菝葜根莖色素的提取效果最佳，因此本試驗選用95%乙醇作為菝葜根莖色素的提取劑。

2.2 最大吸收波長的確定

菝葜根莖色素提取物全波長掃描的吸光值如圖1所示。

圖1 菝葜根莖色素提取最大吸收波長λ 的確定Fig.1 Determination of maximum absorption wavelength of pigment extraction from Smilax china L.

由圖1 可知，在320 nm～340 nm 的波長范圍內(nèi)，菝葜根莖色素的吸光值隨著波長的增加而不斷增大，當(dāng)波長超過340 nm 的時候，吸光值隨著波長的增加而呈下降趨勢。圖形中可看出在340 nm 處形成吸收峰（類黃酮類色素在250 nm～350 nm 之間有明顯的吸收峰[14]）因此確定菝葜根莖色素的最大吸收波長為340 nm，并以此為標(biāo)準(zhǔn)測定各條件下的吸光度。

2.3 單因素試驗對菝葜根莖色素含量影響

2.3.1 提取劑濃度對菝葜根莖色素含量的影響

提取劑濃度對菝葜根莖色素含量的關(guān)系如圖2所示。

圖2 提取劑濃度對菝葜根莖色素含量的影響Fig.2 The effect of extracting concentration on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由圖2 可知，隨著提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，菝葜根莖色素的吸光值隨之升高，在乙醇濃度為50%的時候達(dá)到最大值，之后隨著提取液濃度的升高而降低。原因可能是隨著提取劑濃度的增大，一些雜質(zhì)也隨之溶出，對提取過程中提取液顏色產(chǎn)生了干擾。因此采用50 %的乙醇對菝葜根莖色素進(jìn)行提取最為適合。

2.3.2 提取溫度對菝葜根莖色素含量的影響

提取溫度對菝葜根莖色素含量的關(guān)系如圖3所示。

圖3 提取溫度對菝葜根莖色素含量的影響Fig.3 The effect of extracting temperature on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由圖3 可知，吸光值隨著溫度的升高而呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，在60 ℃后吸光值開始減小，因為隨著溫度升高，菝葜根莖色素在溶液中的溶解度逐漸增大，吸光值則逐漸增大，但當(dāng)溫度較高時，菝葜根莖色素可能發(fā)生了變性或者乙醇溶液揮發(fā)性影響了吸光值，故溫度應(yīng)選擇60 ℃為宜。

2.3.3 提取時間對菝葜根莖色素含量的影響

提取時間對菝葜根莖色素含量的影響如圖4所示。

圖4 提取時間對菝葜根莖色素含量的影響Fig.4 The effect of extracting time on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由圖4 可知，隨著提取時間的延長，色素的提取在不斷地進(jìn)行，溶出物增多，吸光值就明顯增大；但在1.5 h 后吸光值開始減小，這可能是由于溶劑的溶解能力達(dá)到飽和，同時提取出的色素小部分遭到破壞，因此吸光度有所減小，故提取時間定1.5 h 為宜。

2.3.4 料液比對菝葜根莖色素含量的影響

提取時間對菝葜根莖色素含量的影響如圖5。

圖5 提取時間對菝葜根莖色素含量的影響Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on the content of pigment in rhizome from Smilax china L.

由圖5 可知，以 1 ∶10（g/mL）作為料液比對根莖菝葜色素進(jìn)行提取效果最好，料液比和色素提取液的吸光值成反比，因此選用料液比1 ∶10（g/mL）來提取菝葜根莖色素效果最佳。

2.4 正交試驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert.V8.0.6.1對菝葜根莖色素含量進(jìn)行分析[15]，結(jié)果見表3。

從表3 的極差分析可知，各因素對于菝葜根莖色素吸光值的影響順序為：提取溫度＞提取液濃度＞提取時間，故溫度對菝葜根莖色素液的影響最為顯著。通過上述正交試驗的數(shù)據(jù)處理結(jié)果可知菝葜根莖色素的最佳提取工藝為：A3B2C2，即菝葜根莖色素的最佳提取條件為提取溫度70 ℃，提取時間1.5 h，提取液濃度為50%乙醇溶液。然而最佳組合未在上述9 組正交試驗中，因此，需對上述結(jié)果進(jìn)行驗證性試驗。由驗證試驗得：采用最佳提取條件（A3B2C2）提取的菝葜根莖色素溶液吸光度值達(dá)到1.005，高于9 組正交試驗中最高的色素提取液的吸光度值0.895，這說明此次正交試驗優(yōu)化得到的最佳組合的結(jié)果是有效的，可以使菝葜根莖色素提取液的吸光度值達(dá)到最大值。

表3 L（93）3正交試驗設(shè)計及極差分析Table 3 L（93）3orthogonal test design and range analysis

2.5 菝葜根莖色素穩(wěn)定性試驗

2.5.1 氧化劑和還原劑對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響結(jié)果

氧化劑和還原劑對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響如圖6。

圖6 氧化劑和還原劑對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of oxidants and reducing agents on the stability of pigment in rhizome from Smilax china L.

由圖6 所示，加入不同體積分?jǐn)?shù)的氧化劑和不同濃度的還原劑，都使得菝葜根莖色素溶液吸光度變大。由文獻(xiàn)[16]可知根莖色素中含有類黃酮色素，而這種色素里面含有黃酮醇這種物質(zhì)，它具有很強(qiáng)的抗氧化性和抗還原性，在黃酮醇溶液中加入氧化劑和還原劑時，會使得溶液的吸光度變大。所以有可能是黃酮醇的存在導(dǎo)致了溶液最終的吸光值變大。故氧化劑和還原劑會使菝葜根莖色素顏色加深的作用。

2.5.2 常見金屬離子對菝葜根莖色素的穩(wěn)定性的影響結(jié)果

金屬離子對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響如表4。

表4 金屬離子對菝葜根莖色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of metal ions on pigment Stability from Smilax china L.

由表4 可知，Na+、K+、Al3+、Ca2+、Fe3+等離子對菝葜根莖色素有著不同程度的影響作用，F(xiàn)e3+離子對溶液吸光度影響較大，這可能與其離子本身顏色有關(guān)，也可能是色素液中的黃銅化合物和Fe3+發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)使吸光度增大，具體原因有待進(jìn)一步的考察。其余金屬離子對吸光度影響較小，其顏色也基本沒有變化[17]。且24 h 后比色管的底部出現(xiàn)少許紅白色沉淀，原因可能是鹽類物質(zhì)在有機(jī)溶劑中使某些成分的分配發(fā)生了變化。故實際操作中應(yīng)該盡可能的避免菝葜根莖色素液與鐵質(zhì)容器的接觸。

3 結(jié)論

菝葜根莖色素易溶于水，可溶于乙醇等極性溶劑，不溶于石油醚等非極性溶劑。菝葜根莖色素的最佳提取條件為提取溫度70 ℃，提取時間1.5 h，提取液濃度為50%乙醇溶液，各因素對于菝葜根莖色素吸光度值的影響順序依次是提取溫度、提取液濃度、提取時間。由于時間和條件等一些特殊因素的限制，提取條件的優(yōu)化試驗研究結(jié)論還有待進(jìn)一步的完善。另外在探究菝葜根莖色素穩(wěn)定性的試驗結(jié)果中，不同體積分?jǐn)?shù)的氧化劑H2O2和不同濃度的還原劑Na2SO3對菝葜根莖色素有一定的影響；菝葜色素對大數(shù)多金屬離子呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，但Fe3+使色素變色，故在生產(chǎn)實踐中應(yīng)該避免該色素與鐵制品的接觸。研究結(jié)果為菝葜根莖色素的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。