吳 婷，劉 琳，黎 昭，林 賢

（中山大學中山醫(yī)學院廣東省腦功能與腦疾病研究重點實驗室，廣東 廣州 510080）

表觀遺傳調控是一種可逆的遺傳模式，在不改變DNA序列的情況下，表觀遺傳修飾能通過調控基因的表達而改變生物的表型特征。表觀遺傳修飾主要包括幾種模式：DNA甲基化/羥甲基化、組蛋白及非編碼RNA的修飾［1］，其中DNA甲基化是表觀遺傳修飾中最常見的形式。DNA甲基化是指DNA的5-胞嘧啶共價結合一個甲基，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC），其形成與維持需要DNA甲基轉移酶家族（DNA methyltrans?ferase，DNMT）的參與。帕金森氏?。≒arkinson′s disease，PD）是最常見的運動性神經(jīng)退行性疾病，隨著對PD的深入研究，已有學者發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾與PD存在緊密聯(lián)系。在PD病人中，PD的主要風險基因——SNCA基因甲基化水平降低，導致其表達產(chǎn)物α-突觸核蛋白（α-synulein，α-syn）上升［2］，使用左旋多巴可以增加SNCA基因甲基化水平［3］。有報道顯示，MPTP可導致紋狀體的組蛋白H4發(fā)生去乙?；?，而H3出現(xiàn)高度乙酰化與去磷酸化［4］。因此了解PD表觀遺傳調控機制可以幫助我們提供新的治療方向。在本研究中，我們對轉突變的人源α-突觸核蛋白（human α-synuclein，hα-syn），即hA53T α-syn基因小鼠的中腦進行特異性表觀遺傳修飾分析，結果我們獲得A53T突變型hα-syn誘導的PD小鼠的全基因組甲基化圖譜，以生物信息學方法分析481個差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR），并且通過GO功能性富集分析，我們發(fā)現(xiàn)DMR所在基因多富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元投射、樹突等GO條目，該結果為將來進一步研究這些數(shù)據(jù)潛在的生物學意義打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 PD小鼠雜交與鑒定

本文中所使用的實驗小鼠為12月齡C57BL/6小鼠，質量15～20 g。Pitx3+/IRES2-tTA小鼠和tetO-A53T小鼠由美國Jackson Lab提供。所有實驗小鼠在中山大學中山醫(yī)學院實驗動物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)［中山大學（中山醫(yī)學院）實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2015-0107］，12 h：12 h明暗交替，自由進食，并遵守中山大學動物倫理相關準則。將Pitx3+/IRES2-tTA小鼠和tetO-A53T小鼠雜交，經(jīng)鼠尾PCR鑒定后可獲得Pitx3-IRES2-tTA/tetO-A53T雙轉基因小鼠［5］（簡稱Pitx3/A53T小鼠）和同窩非轉基因（non-transgenic，nTg）小鼠分別作為實驗組與對照組，每組各4只。PCR反應如下：95 ℃30 s，65 ℃60 s（每循環(huán)減少0.8 ℃），72 ℃60 s，共10個循環(huán)，隨后再以57 ℃的退火溫度循環(huán)25次。

1.2 全基因組甲基化測序

脫臼處死小鼠，經(jīng)心臟灌流后取小鼠中腦組織，隨后以TIANGEN基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA。考慮到DNA含量要滿足甲基化修飾研究所需，因此我們將2只同年齡同基因型小鼠的組織DNA混合為一個樣本用于后續(xù)實驗，每組各2個重復。以Nanodrop 2000測定DNA純度，以Qubit熒光光度計定量。DNA樣本送至安諾優(yōu)達基因科技公司，采用重亞硫酸鹽測序法（bisul?fite-sequencing，BS-seq）法對樣本進行甲基化測序：DNA經(jīng)隨機打斷成350 bp左右的片段，末端修復后加A尾與測序接頭，用EZ DNA Methylation Lightning Kit（Zymo Research）將未甲基化的C轉換為U，純化隨后進行PCR擴增，構建BS-seq文庫，進而在IlluminaHiSeq 2000平臺進行雙端測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)比對

獲得原始測序數(shù)據(jù)后進行數(shù)據(jù)過濾，從而得到高質量clean reads，隨后應用Bismark軟件將clean reads與小鼠參考基因組（GRCm38.p6）進行比對并組裝，進而獲得甲基化胞嘧啶（methylated cytosine，mC）的信息。

1.4 差異甲基化分析

甲基化水平的計算方式如下：單個C位點的甲基化水平=100×支持甲基化的reads數(shù)目/總的reads數(shù)目。區(qū)域內C甲基化水平=100×該區(qū)域C位點甲基化水平累加之和/該區(qū)域內甲基化C位點個數(shù)。染色體甲基化水平通過劃窗口的方式計算，每個窗口大小為100 kb。

使用DSS軟件檢測差異甲基化胞嘧啶（differ?entially methylated cytosine，DMC）與DMR。甲基化水平符合β-二項式分布，利用DSS軟件對組間的單個C位點甲基化差異進行Wald檢驗［6］。將Bon?ferroni校正的P值小于0.000 05且組間甲基化水平差異大于等于0.1的胞嘧啶作為DMC。將P值小于0.000 05、組間平均甲基化水平差異大于等于0.1、至少包含3個CpG位點的區(qū)域作為DMR。

1.5 功能性富集分析

基于DMR在基因組上結構注釋結果，統(tǒng)計出DMR所在基因在GO各子條目中的分布情況，隨后應用超幾何檢驗［7］，找出與整個基因組背景相比，差異甲基化基因富集到的GO條目。計算式如下：

其中N為所有基因中具有GO注釋的基因數(shù)目；n為N中差異甲基化基因的數(shù)目；M為所有基因中注釋到某特定GO條目的基因數(shù)目；m為注釋到某特定GO條目的差異甲基化基因數(shù)目。經(jīng)FDR校正P值后得到Q值，Q＜0.05時即認為具有統(tǒng)計學意義，該條目為差異甲基化基因富集的條目。

2 結果

2.1 基因型鑒定

小鼠基因型鑒定結果如圖1所示，Pitx3/A53T小鼠同時顯示出tetO-A53T和Pitx3-IRES2-tTA的陽性目的條帶。

圖1 基因型鑒定結果Fig.1 Genotyping results

2.2 甲基化水平分析

我們獲得了每個樣本的甲基化測序結果，染色體甲基化分布圖譜如圖2所示。對不同序列背景下mC的比例進行了統(tǒng)計，如表1所示，我們發(fā)現(xiàn)無論是Pitx3/A53T組（97.09%，n=2）還是nTg組（96.86%，n=2），mC都基本集中于mCG序列背景下。

圖2 染色體甲基化分布圖譜Fig.2 Distribution of chromosomal methylation

表1 mC在不同序列背景的分布情況Table 1 The distribution of mC in different contexts （x，%）

2.3 差異甲基化分析

通過分析Pitx3/A53T小鼠與nTg小鼠的甲基化水平，我們總計發(fā)現(xiàn)了481個DMR，高甲基化與低甲基化DMR分別有257和224個。如圖3所示，這些DMR主要分布于基因的內含子序列，其比例占總的DMR的56.13 %，其次依次為外顯子（20.58%）、CGI（9.56%）。

根據(jù)目前我們掌握的PD分子發(fā)病機制，我們從481個DMR中篩選出了幾個感興趣DMR作為重點研究對象（表2）。

表2 部分DMR信息Table 2 Partial DMR information

2.4 功能性富集分析

差異甲基化基因映射到545個GO子條目（圖4）。如圖5，通過GO富集分析，我們發(fā)現(xiàn)DMR所在基因涉及到樹突發(fā)育、解剖結構發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等功能；從細胞組成成分來看，差異甲基化基因的表達產(chǎn)物主要存在于樹突、神經(jīng)元投射纖維和細胞膜上。

圖3 DMR分布情況Fig.3 The distribution of DMR

3 討論

近年來，表觀遺傳修飾在神經(jīng)性疾病中的調控作用逐漸受到關注。我們應用特異表達人源A53T hα-syn于中腦多巴胺能神經(jīng)元的PD模型小鼠，繪制全基因組甲基化圖譜，探討A53T hα-syn引起的中腦DNA甲基化改變及相關基因涉及的功能。

圖4 差異甲基化基因在GO條目上的分布情況Fig.4 The distribution of methylated genes among GO terms

圖5 GO富集散點圖Fig.5 Scatter diagrams of GO enrichment analyses

我們總共發(fā)現(xiàn)481個DMR，這些DMR中有50%以上分布于內含子區(qū)域，其次是外顯子、CGI、啟動子、UTR5與UTR3。不同的甲基化位點可導致截然不同的表達調控效果。啟動子區(qū)域與第一外顯子區(qū)域的甲基化可沉默基因［8］，此外，外顯子的甲基化作用與可變剪接的調控也有密切聯(lián)系［9］。內含子本身具有增強基因表達的功能［10-11］，然而有證據(jù)顯示，內含子區(qū)域的甲基化并不沉默下游的基因，反而可增強基因的轉錄［12-13］。DNA甲基化表現(xiàn)出了多變的調控方式，這提示我們單憑甲基化狀態(tài)尚不足以推測DNA甲基化對基因表達的影響。

通過篩選DMR，我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)個與PD相關的差異甲基化基因。PINK1是與PD密切相關的風險基因之一，Gautier［14］等發(fā)現(xiàn)PINK1基因與線粒體功能相關，PINK1基因缺失的情況下神經(jīng)元呼吸作用受損。我們檢測到Pitx3/A53T小鼠PINK1基因的啟動子區(qū)域有高甲基化DMR，這表明可能是PINK1基因啟動子區(qū)域的甲基化引起了基因沉默，進而導致線粒體功能失調。Foxp1被證明可促進Pitx3的表達［15］，而Pitx3是中腦多巴胺能神經(jīng)元分化與存活必不可少的一種同源框蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)該基因的內含子區(qū)域出現(xiàn)高甲基化，這提示Pitx3/A53T小鼠的中腦部位的Foxp1可能出現(xiàn)補償性增加，以抵抗多巴胺神經(jīng)元丟失。與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）相關的基因，如Ubqln2、HECTD4、Rnf157也出現(xiàn)了甲基化水平的改變。這些UPS相關基因的表達紊亂可能干擾蛋白質的正常降解，引起毒性蛋白質的累積。本文明確以上基因在Pitx3/A53T小鼠中腦部位的甲基化變化，但是仍需進一步確認差異甲基化基因的表達發(fā)生了何種變化以及該基因在PD的發(fā)生發(fā)展過程中起到何種作用。

GO富集結果顯示，Pitx3/A53T小鼠中腦部位的差異甲基化基因與樹突結構相關，這提示我們參與樹突發(fā)育的甲基化差異基因或許具有較高的研究價值。臨床研究也證實PD患者的紋狀體神經(jīng)元樹突有明顯的退化［16］，隨后，Day［17］等報道稱α-syn可誘導該現(xiàn)象的發(fā)生，且在路易體癡呆中也存在類似的病理學特征［18］。在黑質多巴胺能神經(jīng)元內，自噬功能的缺失可引起α-syn聚集，進而可導致TH+神經(jīng)元樹突的異常膨脹［19］。樹突是建立神經(jīng)元間聯(lián)系的重要解剖結構，研究［20］表明，樹突的可塑性與焦慮、緊張情緒密切相關。在這些情緒的影響下，海馬、前額皮質、杏仁核的樹突可出現(xiàn)形態(tài)學改變。由于臨床上PD發(fā)病過程往往伴有非運動性癥狀，因此本研究結果之一——樹突發(fā)育相關基因具有差異性甲基化——可為PD分子發(fā)病機制提供潛在的研究靶點。差異甲基化基因的功能也與神經(jīng)元投射相關，這同樣也是影響神經(jīng)環(huán)路的一個重要因子。神經(jīng)元投射相關的差異甲基化基因，如基因Tenm2和Tenm3參與神經(jīng)元軸突導向的過程［21-22］；Kcnab2基因的表達產(chǎn)物為電壓門控鉀離子通道亞基，該基因的甲基化水平發(fā)生變化將會影響神經(jīng)信號在整個神經(jīng)環(huán)路的傳導。

DNA甲基化豐富基因的調控方式，也為我們提供一個新角度研究PD致病機制。我們將在本研究結果基礎上，將來進一步深入研究這些數(shù)據(jù)潛在的生物學意義，探討DNA甲基化與PD發(fā)生發(fā)展之間的生物學聯(lián)系。