王永妍 趙炳赫 梁廣鈺 李云 徐仰倉

（1. 天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457；2. 上饒師范學院，上饒 334100）

近年來，海水養(yǎng)殖業(yè)因其具有養(yǎng)殖效率高、占地面積少、方式多樣化、節(jié)約水資源等優(yōu)點而蓬勃發(fā)展，但在高密度、集約化養(yǎng)殖模式下，餌料投放、排出的糞便和魚藥濫用都會直接或間接影響水質(zhì)平衡。氨氮、亞硝酸鹽、硫化物及COD等是養(yǎng)殖海水中常見的有害物質(zhì)。目前主要采用化學、物理和生物的方法進行去除。與傳統(tǒng)方法相比較，微生態(tài)制劑成本低，能夠徹底凈化水體并且對海產(chǎn)品有益。美國商品型養(yǎng)殖海水菌劑可以有效減少換水需求，在一定時間內(nèi)消除水體中的氨氮和亞硝酸鹽。微生物在生態(tài)系統(tǒng)中對環(huán)境變化比較敏感［1］，不同時期不同環(huán)境下使用菌劑處理養(yǎng)殖海水可能會產(chǎn)生不同效果，因此研究將菌劑投入到養(yǎng)殖海水后，水體中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可以在一定程度上反映其效果和變化趨勢，對合理利用微生態(tài)制劑和實現(xiàn)海水養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

高通量測序技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛應用于環(huán)境微生物研究等方面［2］，通過16S rRNA可以分析出微生物多樣性。呂寧［3］測定對蝦養(yǎng)殖水體連續(xù)5個月的理化指標、微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其變化，得出水質(zhì)因子和微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)存在相關性，李可［4］對對蝦養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性進行了分析并從中篩選出了有益的菌株開發(fā)微生態(tài)制劑。但很少有針對于在不同時期使用完菌劑，再對養(yǎng)殖海水中微生物群落進行測定的研究。本文將美國商品型菌劑分別于冬、春、夏3個季節(jié)投入到養(yǎng)殖海水中，基于IonS5TMXL 測序平臺研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，旨在揭示菌劑的功能隨季節(jié)變化趨勢以及水體中細菌和環(huán)境因子的關系，為以后養(yǎng)殖海水治理和微生態(tài)制劑的研制與應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

微生態(tài)制劑：美國商品型養(yǎng)殖海水凈水劑

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 為檢測不同季節(jié)養(yǎng)殖海水在凈水劑投入后微生物菌群的變化和多樣性，分別于2019年1月、2019年4月、2019年7月在天津某海水養(yǎng)殖廠投入商品型菌劑，3 d后采集樣品（不同時期同時取3個樣品作為平行）。海水樣品的溫度、鹽度、溶解氧和pH當場使用儀器測定并記錄，然后使用滅菌的玻璃瓶收集海水樣品，在低溫下運回實驗室［5］。

1.2.2 總基因組DNA提取 將2 h內(nèi)運回實驗室現(xiàn)場收集的海水樣品立即進行處理：取1 L海水，經(jīng)滅菌后的3 μm和0.22 μm微孔濾膜兩級過濾后，棄去3 μm微孔濾膜，0.22 μm微孔濾膜上即壓載水微生物，使用滅菌的鑷子，將0.22 μm濾膜轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，對3個季節(jié)收集的養(yǎng)殖海水樣品進行編號，冬季樣品標記為RZ1，春季樣品標記為RZ2，夏季樣品標記為RZ3，然后立即放入-80℃冰箱中冷凍4 h，取出冷凍后放有微生物濾膜的離心管，使用滅菌剪刀和鑷子，將0.22 μm濾膜剪碎轉(zhuǎn)移到1.5 mL滅菌離心管中，然后使用試劑盒對微生物的DNA 進行提?。?］。

1.2.3 細菌16S rRNA的高通量測序 將提取的DNA樣品稀釋至20 ng/μL后作為PCR模板，使用帶有Barcode標簽的特定16S rRNA V3、V4區(qū)引物（515F和806R）進行擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，并用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物后，使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序［1，6］。利用Qimme對有效序列進行質(zhì)量過濾，并通過Mothur去除嵌合體，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列，然后使用UCLUST對優(yōu)質(zhì)序列進行聚類成為OTU，最后，通過blast將OTU代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對，對OTU代表序列進行注釋，獲得每個OTU的分類學信息。去掉原始OTU中 可信度較低的序列，所得數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。最后進行OTU豐度與 Alpha 多樣性計算，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息［7-8］。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel處理數(shù)據(jù)，用SPSS 25.0進行相關性和顯著性差異分析，水質(zhì)理化指標采用One-way ANOVA（單變量因素方差分析），與細菌多樣性指數(shù)之間的關系采用Pearson相關性分析；門和屬分類水平柱形圖使用Origin8.0完成；通過Canoco 4.5對優(yōu)勢屬的相對豐度和環(huán)境因子進行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖海水環(huán)境特征

經(jīng)測定養(yǎng)殖海水在冬季到夏季3個季節(jié)中溫度變化范圍為4.4-28.2℃，鹽度變化范圍為15.8-19.1，溶解氧變化范圍為5.2-11.1mg/L，pH變化范圍為7.96-8.10，如表1所示?？梢钥闯龆竞拖募攫B(yǎng)殖海水溫差比較大，但是冬季鹽度和溶解氧卻相對來說較高。采用SPSS 25.0軟件對水環(huán)境指標分別進行One-way ANOVA（單變量因素方差分析）顯著性檢驗和Person相關性分析，結(jié)果顯示除夏季和冬季pH沒有顯著差異（P=0.05），其余3個季節(jié)中溫度、鹽度、溶解氧和pH兩兩之間均存在顯著性差異（P＜0.05），溫度和溶解氧呈極顯著負相關（P＜0.01）。

表1 天津某海水養(yǎng)殖廠水質(zhì)指標

2.2 三個季節(jié)細菌群落多樣性分析

2.2.1 物種多樣性曲線分析 從冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，根據(jù)它們所代表的OTUs數(shù)目，以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應的物種數(shù)來構(gòu)建曲線（圖1）。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種豐富程度，從圖中可以看出在97%相似性水平下冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3隨著測序深度增加，曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的序列數(shù)只會產(chǎn)生少量新的OTU，測序深度足以覆蓋大多數(shù)菌。3條曲線RZ3位于最上方，表明RZ3在這3種菌中物種豐富度是最高的，夏季的養(yǎng)殖海水環(huán)境和條件可能更有利于微生物菌群的生長和繁殖。

圖1 97%相似水平下樣品的稀釋性曲線

2.2.2 Alpha Diversity指數(shù)分析 Alpha Diversity 用于分析樣本內(nèi)（Within-community）的微生物群落多樣性，通過對樣本的多樣性分析可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。Alpha Diversity分析指 數(shù) 包 括 shannon、simpson、chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree。冬季RZ1、春季RZ2、夏季RZ3三種復合菌的Alpha多樣性分析見表2。觀測物種數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高，Shannon指數(shù)反映群落的多樣性，Simpson指數(shù)反映群落中優(yōu)勢種的集中程度，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種多樣性越高［9］。上述結(jié)果顯示微生物豐富度和多樣性整體情況夏季＞春季＞冬季，夏季物種豐富，而冬季和春季物種相對單一。PD_whole_tree指數(shù)反應了樣品中物種對進化歷史保存的差異，PD_whole_tree指數(shù)越大說明物種對進化歷史保存的差異越大［10］。goods_coverage指數(shù)反應了測序的深度，goods_coverage指數(shù)越接近于1，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種。

表2 RZ1、RZ2、RZ3三種樣品多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.3 細菌群落組成與結(jié)構(gòu)

2.3.1 序列拼接組裝與OTU聚類分析 冬季養(yǎng)殖海水RZ1通過16S rDNA高通量測序技術(shù)過濾掉低質(zhì)量堿基后共得到原始序列78 148條，然后進行嵌合體過濾，最終用于后續(xù)分析的有效序列67 069條。按照上述篩選方法，春季RZ2過濾掉低質(zhì)量堿基后的原始序列為84 025條，用于后續(xù)分析的有效序列為67 743條，夏季RZ3分別為76 206條和62 732條。為了研究各樣本的物種組成，對所有樣本的有效序列以97%的一致性進行OTUs聚類，RZ1、RZ2、RZ3分別有134、162、194個OTUs。通過OTUs聚類的結(jié)果表明，RZ1混合菌分屬于13個門，18個綱，38個目，65個科，89個屬；RZ2混合菌分屬于15個門，19個綱，43個目，60個科，77個屬；RZ3混合菌分屬于16個門，22個綱，47個目，48個科，58個屬，以上分析結(jié)果如表3所示。

表3 RZ1、RZ2、RZ3三種樣品16S rDNA高通量測序基本信息

2.3.2 不同水平的細菌組成 利用RDP classifier 對各樣品 OTU 從門到屬依次進行分類信息分析，挖掘在3個季節(jié)中加入復合菌劑后養(yǎng)殖海水樣品在各個水平上的菌群結(jié)構(gòu)。選取每個分組在門、屬分類水平上最大豐度排名前十的物種并進行對比，生成物種相對豐度柱形圖（圖2）。

在門分類水平上，3種養(yǎng)殖海水樣品中共同相對豐度較高的菌門依次為變形菌門（Proteobacteria，55.16%-72.18%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，18.86%-40.34%），另外放線菌門（Actinobacteria，2.8%）為冬季RZ1樣品中的優(yōu)勢菌門，厚壁菌門（Firmicutes，1.24%-2.13%）是冬季RZ1和春季RZ2樣品的共有優(yōu)勢菌門，夏季RZ3樣品中豐度相對較高的還有綠彎菌門（Chloroflexi，2.82%）和疣微菌門（Verrucomicrobia，1.40%）。在已分類的優(yōu)勢門中，只有放線菌門和厚壁菌門為革蘭氏陽性細菌，其余菌門均是革蘭氏陰性細菌。在不同時期的養(yǎng)殖海水樣品中，變形菌門作為豐度最大的優(yōu)勢菌門，包含γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，14.47%-61.12%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，8.48%-62.99%），可以看出RZ1、RZ2、RZ3在綱水平優(yōu)勢菌豐度所占百分比相差較大。

在屬分類水平上，冬季RZ1的優(yōu)勢菌為Tenacibaculum（38.28%），卓貝爾氏菌屬（Zobellella，30.78%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，13.55%）。春季RZ2優(yōu)勢菌為Glycocaulis（34.00%）、鹽單胞菌屬（11.36%）、Planktosalinus（9.67%）。 與 RZ1相比，RZ2優(yōu)勢菌占整體相對豐度值并不大。夏季RZ3優(yōu)勢菌為Pseudofulvimonas（28.94%）、Zobellella（17.51%）、Planktosalinus（15.86%）、 海 桿 菌 屬（Marinobacter，12.30%）。

2.3.3 細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關系 將3個季節(jié)的養(yǎng)殖海水樣品細菌多樣性指數(shù)與環(huán)境因子之間進行相關性分析（表4），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與溫度呈顯著正相關，與溶解氧呈顯著負相關；ACE指數(shù)與鹽度呈顯著負相關，Chao1指數(shù)和PD_whole_tree與其它環(huán)境因子間的相關性均未達到顯著性水平。說明在投入菌劑之后，3個季節(jié)養(yǎng)殖海水樣品中的細菌多樣性和豐富度主要受溫度、鹽度、溶解氧的影響，在此過程中pH變化并不大，所以pH對群落結(jié)構(gòu)可能沒有顯著影響。

用RDA分析細菌主要群落與水質(zhì)環(huán)境因子之間的關系，如圖3所示，Planktosalinus、Pseudofulvimonas、海桿菌屬與溫度和pH呈顯著正相關，卓貝爾氏菌屬、Tenacibaculum、Pseudomonas也與pH呈正相關，但與溫度呈負相關；Lactococcus、鹽單胞菌屬、Pseudomonas、Tenacibaculum、卓貝爾氏菌屬與鹽度和溶解氧呈正相關，而Acinetobacter、Glycocaulis也與溶解氧呈正相關。

圖2 養(yǎng)殖海水樣品細菌類群門（A）和屬（B）水平分布圖

表4 水體細菌多樣性指數(shù)與水體環(huán)境因子之間的相關性

3 討論

水溫、鹽度、溶解氧和pH不僅是水環(huán)境物理參數(shù)，還是養(yǎng)殖海水中不可或缺的環(huán)境因子，而且會影響水生生物的生理狀態(tài)［11］。李潤玲［11］在研究海水環(huán)境因子變化對遼寧灣貝類免疫相關酶活性影響時，表明水溫變化會影響水體溶解氧和pH的變化。Ludlam等［12］認為水溫是決定溶解氧飽和度的重要因素，水溫越低，水中溶解氧含量越高，另外pH值也和二者有很高的相關性［13］。

圖3 細菌群落與環(huán)境因子的RDA圖

在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，海水溫度、鹽度和營養(yǎng)鹽等是影響細菌群落分布的最主要因素［14-15］。李麗娜［16］在研究環(huán)境因素對水稻土中發(fā)酵微生物群落的影響時，提出了不同初始pH和培養(yǎng)溫度都可以改變物種豐富度指數(shù)和Shannon指數(shù)。由此可以推斷物種多樣性指數(shù)可能和養(yǎng)殖海水的環(huán)境因子有關，溫度較高，鹽度和溶解氧偏低增加了微生物多樣性，夏季觀測物種數(shù)大約是冬季的1.5倍。

擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、綠彎菌門廣泛存在于蝦蟹貝養(yǎng)殖池塘中［17］，這也和天津塘沽某海水養(yǎng)殖廠實際情況相符合。不同時期養(yǎng)殖海水菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，只是主要菌種存在一定差異，3個季節(jié)樣品中優(yōu)勢菌群分配不均，可能是加入微生態(tài)制劑之后菌群隨溫度、鹽度、溶解氧、pH的不同出現(xiàn)了變化，除此以外養(yǎng)殖海水中初始菌群也應該是使細菌多樣性發(fā)生變化的一個重要因素，微生物之間存在競爭和互利共生的關系導致相互作用產(chǎn)生影響［18-19］，而且養(yǎng)殖海水中可能還有豐富的有機質(zhì)。Tenacibaculum是一個新的屬，它在養(yǎng)殖過程中可導致大菱鲆發(fā)生屈撓桿菌病［20］。Zobellella為革蘭氏陰性菌，中度嗜鹽，分布在海水好氧反硝化，對高濃度亞硝酸鹽具有較好的耐受性，可以有效的去除硝酸鹽、亞硝酸鹽氮，因此被應用于處理養(yǎng)殖廢水的過程中。有研究表明對來自不同生境的污水污泥樣品進行篩菌，反硝化效果較好的菌株主要為γ-變形菌綱的鹽單胞菌屬和卓貝爾氏菌屬［21］，鹽單胞菌是鹽單胞菌科（Halomonadaceae）中最大的一個屬，在海水等鹽度較高的環(huán)境中占有較高比例［22］，而冬季RZ1養(yǎng)殖海水樣品鹽度值高，可能更有利于鹽單胞菌屬的生長。Glycocaulis為革蘭氏陰性菌，具有運動性、需氧性、嗜溫性和中度嗜鹽性特點，可從石油污染鹽漬土和海洋中分離出來，養(yǎng)殖海水對碳氫化合物的值有一定限制，此菌種能夠有效降解碳氫化合物。屬于擬桿菌門黃桿菌科的Planktosalinus參與有機物降解、異養(yǎng)反硝化、自養(yǎng)反硝化和氨氧化過程。γ-變形菌綱的Pseudofulvimonas也具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化功能［23-24］。海桿菌屬是中度嗜鹽菌的重要組成部分，主要分布在不同的海洋環(huán)境中，如海沙、海灘淤泥、北極冰面、有殼的海洋生物表面等［25］。微生物在氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，亞硝酸鹽對人體及養(yǎng)殖動物都存在較大的毒害，對某些細菌亦是如此，隨著亞硝酸鹽含量升高，菌株生長速度減緩甚至生長會被完全抑制［26］。目前針對養(yǎng)殖環(huán)境及污水等環(huán)境中與氮循環(huán)有關的微生物多樣性的報道有很多，研究表明反硝化效率高，對硝酸鹽和亞硝酸鹽耐受性好的菌株在處理高濃度亞硝態(tài)氮廢水的應用中具有一定價值。假單胞菌屬、鹽單胞菌屬、海桿菌屬中的一些種可以進行反硝化［27］，并且鹽單胞菌屬、卓貝爾氏菌屬為高效反硝化菌，在最適條件下能將硝酸鹽、亞硝酸鹽完全去除［21］，Planktosalinus、Pseudofulvimonas也表現(xiàn)出異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的能力，這些菌屬在含氮廢水和高濃度亞硝酸鹽廢水處理方面有很大應用潛力。RZ1、RZ2、RZ3在優(yōu)勢菌屬水平方面有所區(qū)別，但也有一定相似性，由于3個季節(jié)樣品中的優(yōu)勢菌能夠降解氨氮、亞硝酸鹽，因此推測出將微生態(tài)制劑投入到養(yǎng)殖海水中，不同時期細菌組成結(jié)構(gòu)和多樣性跟隨環(huán)境因子表現(xiàn)出變化，但可能仍具有調(diào)節(jié)養(yǎng)殖海水水質(zhì)的能力。

微生物在生態(tài)系統(tǒng)中對環(huán)境變化比較敏感，而溫度、鹽度和營養(yǎng)鹽是影響細菌群落分布的最主要因素。在溫度較低，鹽度較高的冬季，出現(xiàn)了豐度較高的致病菌Tenacibaculum，但另外一些有益菌也發(fā)揮了相應的優(yōu)勢。鹽單胞菌屬適應能力強，對鹽度依賴大［28］，春季和夏季鹽度依次遞減，鹽單胞菌屬的生長也不斷受到限制，說明水體鹽度在微生物多樣性方面起到了一定作用。除此以外假單胞菌屬對營養(yǎng)要求簡單，能夠在低溫下生長［29］，潛在益生菌乳酸菌屬會降低致病菌等危害因素。春季RZ2水質(zhì)指標處在中間水平，Planktosalinus與溫度呈顯著正相關，所以夏季此菌屬相對豐度高于春季，Planktosalinus也是春季和夏季發(fā)揮異養(yǎng)硝化、好氧反硝化功能的主要菌屬。夏季RZ3中假單胞菌屬是3個季節(jié)中豐度最低的，有研究推測假單胞菌的分布與季節(jié)性溫度變化有關［30］，這也就表明水體溫度是影響群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的主要因素。從RDA圖可以看出夏季優(yōu)勢菌種和pH呈顯著正相關，3個季節(jié)養(yǎng)殖海水都偏弱堿性，pH值幾乎接近，而且豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)都和pH沒有顯著相關性，推測此養(yǎng)殖海水樣品中的菌群受季節(jié)pH變化影響不大。水體溫度和溶解氧呈極顯著負相關性，冬季溶解氧含量較高，RZ1樣品優(yōu)勢菌種與溶解氧呈正相關性，所以夏季和冬季菌種豐度有所差別。整體來看3個季節(jié)大多數(shù)菌種都具有去除氨氮、亞硝酸鹽的能力，說明水質(zhì)環(huán)境因子雖然改變了微生物的多樣性，但微生態(tài)制劑依然保持相應的作用，只是可能會在不同時期表現(xiàn)出不同的效果，3個季節(jié)下微生態(tài)制劑凈化養(yǎng)殖海水的功能在以后還需進行深一步的測定。用，只是可能會產(chǎn)生不同效果。

（3）微生態(tài)制劑的應用對維持養(yǎng)殖海水穩(wěn)定起重要作用，不同季節(jié)下微生物群落結(jié)構(gòu)有一定差異，但也發(fā)揮了各自的調(diào)控能力，這為以后微生態(tài)制劑的研制和應用提供了新方向、新思路，而且通過此項研究某些菌株的特性和能力也被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其獨特生理代謝、功能特征，對治理其它廢水和生物修復有重要價值。

4 結(jié)論

（1）不同季節(jié)的環(huán)境因子，溫度、鹽度、溶解氧、pH都會對投入微生態(tài)制劑后的養(yǎng)殖海水菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性產(chǎn)生影響，但由于3個季節(jié)的pH值相差不大，所以pH在決定優(yōu)勢菌群和物種相對豐度方面并不占據(jù)主要地位。

（2）3個季節(jié)的細菌結(jié)構(gòu)組成和多樣性有所差別，但優(yōu)勢菌屬具備去除氨氮和對高濃度硝酸鹽、亞硝酸鹽耐受性的能力，說明微生態(tài)制劑在環(huán)境因子的影響下菌群發(fā)生變化，可能依然保持相應的作