馬明蔥，李曉雨，萬喬，陳志旭，卓超

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510000)

肺炎克雷伯菌，屬于革蘭陰性桿菌，可引起肺部感染、泌尿道感染和血液感染等[1]。近年來社區(qū)來源的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvkp)受到廣泛關注，是微生物感染的研究熱點。高毒力肺炎克雷伯菌是臺灣的科學家1986年發(fā)現(xiàn)的[2]，隨后在臺灣，韓國及其他亞洲國家均有報道[2,3,4]，而且在亞洲以外國家的報道也有所增加[5,6,7]。在其它地區(qū)報道的hvkp感染患者也主要是亞裔居民。hvkp不僅是導致肝膿腫的重要病原菌，還可引起腦膜炎、壞死性筋膜炎和眼內炎等轉移性感染[8,9]，其進展快、預后差，給患者的生命帶來極大威脅。hvkp菌株在瓊脂平板上的菌落表現(xiàn)為高黏液性(hypermucoviscous)，即拉絲實驗陽性，則判斷為高黏液表型菌株[5]，故既往將高毒力肺炎克雷伯菌又稱為高黏液表型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous klebsiella pneumoniae，hmkp)。但對于高黏液表型肺炎克雷伯菌是否等同于高毒力肺炎克雷伯菌，近年報道也存在爭議，有研究通過小鼠實驗表明，僅少數(shù)(1/5)的高黏液表型菌株表現(xiàn)為高毒力[10]。

鐵載體氣桿菌素(iucA)占hvkp總的鐵載體產量的90.0%以上，和敲除氣桿菌素的菌株相比，含有氣桿菌素的菌株可使小鼠模型的毒力增加100倍[11]。有關hvkp菌株的定義尚無統(tǒng)一標準。Thomas A. Russo等表明拉絲實驗定義hvkp的準確性能達到90.0%，iucA定義hvkp的準確性可達96.0%[12]。因此，在本文中我們將拉絲實驗和iucA基因陽性的肺炎克雷伯菌定義hvkp。與hvkp相對應的是典型肺炎克雷伯菌(classic klebisella pneumonia，ckp)，ckp主要見于醫(yī)院感染，常因對頭孢菌素、碳青霉烯類的耐藥使其成為多重耐藥菌。普遍認為ckp的毒力較低，但2016 年中國浙江的一家醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了攜帶blaKPC-2克隆株ST11，可獲得高毒力質粒，成為高耐藥和高毒力菌株，并造成患者致命的結局[13-14]。因此，基于這種細菌的進化現(xiàn)象，以耐藥性來區(qū)分hvkp和ckp只是相對而言的，須根據每個菌株的多種生物學特征予以判斷。本研究的主要目的是比較性研究中國廣東地區(qū)的hvkp和ckp的臨床特征、細菌耐藥性、分子流行病學特點及相關毒力情況。

1 材料與方法

1.1 收集菌株及患者臨床資料

對2016年11月到2018年4月從廣東省4家醫(yī)院收集的194株培養(yǎng)陽性的肺炎克雷伯菌進行回顧性研究。排除同一患者的重復分離株。所有細菌均經Vitek 2 compact全自動化微生物分析系統(tǒng)進行細菌鑒定，儲存于-80℃。并經16S rRNA基因測序再次鑒定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 拉絲實驗

用接種環(huán)蘸取新鮮的肺炎克雷伯菌菌落，將接種環(huán)向上提起，若菌落形成的黏絲長度大于5 mm，則判定為拉絲實驗陽性，反之則陰性。拉絲試驗陽性的菌株為高黏液表型菌株[5]。

1.3 藥物敏感性試驗

采用肉湯稀釋法測定肺炎克雷伯菌對6種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，結果判斷參照2017年美國臨床和實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的折點[15]。6種抗菌藥物為亞胺培南，頭孢呋辛，頭孢曲松，頭孢吡肟，環(huán)丙沙星和亞胺培南，均購自廣州鼎國生物技術有限公司。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.4 菌株MLST分型

采用煮沸法提取菌株DNA的模板。PCR體系：PCR上下游引物各1.0 μL，Premix12.5 μL，超純水9.5 μL，DNA模板1.0ul，總共25.0 μL。PCR反應條件詳見https://pubmlst.org網站。PCR陽性產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，并登錄(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&page=sequenceQuery)網站獲得7個管家基因數(shù)目，和數(shù)據庫中的7個管家基因比對后獲得ST型。

1.5 血清型與毒力基因

毒力基因及血清型的PCR模板提取及反應體系同前，PCR特異性引物參照文獻合成[12,16,17]。所得陽性產物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，并上傳BLAST數(shù)據庫比對分析。

1.6 蠟螟實驗

參照文獻中蠟螟實驗標準方法[18]，并做簡要修改。

1.6.1方法 收集孵育于LB瓊脂平板上18-20 h分純的臨床肺炎克雷伯菌，將單菌落加PBS(PH=6.5)調麥氏比濁度為0.5，按照預先涂板計算的0.5麥氏的菌落量(cfu/ml)。依照10的倍數(shù)進行稀釋，得到104-107cfu/ml的細菌懸液。實驗組注射肺炎克雷伯菌菌液，對照組僅注射PBS。注射蠟螟的菌液需再次涂板計數(shù)驗證細菌量。

1.6.2蠟螟體內注射 選取300-400 mg健康狀態(tài)良好(體白、運動活躍、翻身能力強等)的成熟幼蟲(人工飼料喂養(yǎng)(奶粉，蜂蜜，蜜蠟，小麥粉，玉米面)，相對濕度為60%-70%，并常規(guī)進行消毒)，用注射器吸取20.0 ul細菌懸液，在蠟螟偽足的第一腹節(jié)進針，將細菌懸液注入蠟螟體內。所有的194株菌均進行蠟螟實驗，每株細菌分4個不同濃度(104-107cfu/ml)，每個濃度的細菌菌液需注射30只蠟螟(即每組10只，重復3次)，則一株細菌需120只蠟螟。將感染的蠟螟放置培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿只放10只感染的蠟螟，37 ℃避光培養(yǎng)。

1.6.3記錄結果 間隔12 h(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)記錄蠟螟死亡數(shù)量，并用回歸分析方法中的probit概率法計算LD50(log10cfu/ml)，各組進行比較時采用t檢驗或單因素分析。

1.7 數(shù)據處理與統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，對計量資料采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素分析，計數(shù)資料比較用卡方檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 菌株的來源及hvkp菌株的陽性率

2016年11月到2018年4月，從廣東省4家醫(yī)院共收集了194株培養(yǎng)陽性的肺炎克雷伯菌，血標本來源的肺炎克雷伯菌為70.1%(136/194)(圖1)。本研究中hvkp的比例為33.0%(64/194)。

圖1 194株肺炎克雷伯菌的標本來源

2.2 藥物敏感性實驗

和ckp菌株相比，hvkp對本研究中的大多數(shù)抗菌藥物更敏感(P<0.05)。hvkp菌株對亞胺培南、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟和環(huán)丙沙星的耐藥率顯著低于ckp菌株。(見表2)

表2 hvkp/ckp，血清型K1/K2的毒力基因百分比

表1 hvkp和ckp對不同抗菌藥物的耐藥情況比較

2.3 菌株MLST分型

對所有菌株(194株)進行MLST分析，共有75個ST型，未分型9株(均在ckp組)。hvkp中主要的ST型為ST23(17/64,26.6%)、ST65(12/64,18.8%)、ST86(8/64,12.5%)，這3種ST型占總的hvkp的比例為57.8%(37/64)。ckp中主要的ST型為ST11(18/130,13.9%)、ST15(6/130，4.6%)，ST37(5/130,3.8%)，這3種ST型占總的ckp的比例為22.3%(29/130)。

2.4 血清型與毒力基因

2.4.1血清型 hvkp中92.2%(59/64)的菌株可進行血清分型，ckp中僅17.7%(23/130)的菌株可進行血清分型。64株hvkp的血清型分型中，K2型最多，占40.6%，其他血清型依次是K1型28.1%，K57型占15.6%，K20型占4.7%，K5型占3.2%，未發(fā)現(xiàn)血清型K54(見圖2)。130株ckp的血清型分型中，K1型為6.2%，依次是K2型5.4%，K54型占3.1%，K20型占1.5%，未發(fā)現(xiàn)血清型K5。血清型K1、K2、K57在hvkp中的檢出率顯著高于ckp(P<0.05)。

圖2 hvkp和ckp中不同血清型的百分比

2.4.2毒力基因 hvkp菌株中毒力基因rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344、Alls、entB、ycfM、Irp-2、ybts、fimH、kfuB、wabG、uge、magA等的陽性檢出率高于ckp菌株的檢出率，其余毒力基因的陽性率在兩組間無明顯區(qū)別(詳見表3)。血清型K1菌株中毒力基因kfuB、magA的陽性檢出率高于血清型K2，而K1的毒力基因kpn的陽性檢出率低于K2。其余毒力基因的檢出率在血清型K1和K2間無統(tǒng)計學差異(詳見表3)。

2.5 蠟螟實驗

蠟螟實驗結果表明，總的來說hvkp的LD50低于ckp(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.035)，高黏液表型肺炎克雷伯菌的平均LD50低于非高黏液表型肺炎克雷伯菌(5.4±0.7(log10cfu/ml)vs5.6±0.7(log10cfu/ml)，P=0.026)。

比較hvkp和ckp間差異顯著的毒力基因(P=0.000)，以及血清型K1和K2間有區(qū)別的的毒力基因菌株，hvkp中毒力基因kpn陽性的菌株的LD50大于相應的ckp菌株，差異有統(tǒng)計學差異(P=0.016)。其余表型的肺炎克雷伯菌感染蠟螟的LD50詳見表3。

表3 hvkp和ckp中肺炎克雷伯菌感染蠟螟的LD50(log10cfu/ml)的比較

3 討論

對2016年11月到2018年4月從廣東省4家醫(yī)院收集的不同感染部位的194株肺炎克雷伯菌進行回顧性研究。本文中hvkp的比例為33.0%，低于我國北京對于老年人的一項6年的研究中的hvkp的比例(45.7%)[19]，但高于國外西班牙(6.0%)，加拿大(8.2%)等地區(qū)[5]。

除少數(shù)地區(qū)發(fā)現(xiàn)高毒力的肺炎克雷伯菌耐藥外[13]，大多數(shù)研究表明肺炎克雷伯菌高毒力株對常用抗菌藥物高度敏感[20]，本研究結果與上述文獻報道基本一致。本組資料顯示64株hvKp菌株中發(fā)現(xiàn)5株耐藥菌株，其中一株ST65-K2表型的hvkp為多重耐藥菌株(MDR)，對亞胺培南敏感。該菌株分離自胸腔感染患者的胸腔引流液，其毒力較強，感染蠟螟的LD50為4.5，與高毒力參考菌株K1 血清型NTUH-K2044的LD50(4.1±0.3)相近[18]。該菌株的毒力和耐藥機制相互關系有待下一步研究。

先前研究表明，血清型K1在hvkp中是最常見的[14,20]，但在本研究分離的64株hvkp中，血清型K2最多，高達40.6%；K1次之(28.1%)。文獻報道ST23型與血清型K1和肝膿腫密切相關[5]，我們的研究結果與此相一致，但本研究中僅8例肝膿腫，可能與血清型K1少有關系。本研究還發(fā)現(xiàn)，ST700和ST2059也與血清型K1相關，此兩類菌株均來源于血液標本，但因臨床資料欠全，是否因肝膿腫播散性感染未能考證。來自新加坡，香港，臺灣的研究表明，血清型K2的ST型較多樣(8種ST型)[21]。本文中血清型K2的ST型也較多樣，以ST65最常見。先前的研究表明ST268僅與血清型K20相關[22]，本文中的ST268和ST893均為血清型K20。與既往研究一致，血清型K1、K2、K57與hvkp相關[22-23]。

既往研究顯示，rmpA/rmpA2，調節(jié)胞外脂多糖的合成，與高黏液表型密切相關，也認為是hvkp 重要生物標記物[24,25]，但在本研究中僅66.7%的hvkp為rmpA陽性，提示可能存在其他機制調節(jié)高黏液表型的表達[25]。此外，Guo等收集多種感染部位的肺炎克雷伯菌，結果表明與non-hvkp相比，hvkp中rmpA多，但rmpA在血清型K1和K2間無區(qū)別，與本文中hvkp的研究結果一致[22]。鐵載體腸桿菌素(entB)、氣桿菌素(iucA)、沙門菌素(iroB)、耶爾森菌素(ybts,irp-2)、kfu等均介導三價鐵的攝取，均是肺炎克雷伯菌感染的重要的毒力因子[26,27,28]。本文中iucA、iroB、ybts、irp-2、kfu等在hvkp中的陽性率高于ckp，和既往的研究一致。既往研究表明血液和肝膿腫中的肺炎克雷伯菌的血清型K1均有kfuB基因，但血清型K2均無[29]。Lin等收集香港、新加坡和臺灣的肝膿腫和非感染性攜帶者的血清型K2，結果表明血清型K2中kfuB基因的比例為11.5%[30]。本研究表明，K1中kfuB基因的比例為66.6%，K2中kfuB基因的比例為26.1%，表明kfu與血清型K1無特異性的關系。本研究中大多數(shù)的菌株攜帶fimH基因，但在hvkp菌株中的陽性率高于ckp，差異有統(tǒng)計學意義，與既往研究一致[22]。另外一個與菌毛相關的基因kpn，其陽性率在hvkp和ckp間無明顯差異，但在血清型K2中的陽性率高于K1。

和既往小鼠模型研究結果一致[31]，本研究蠟螟實驗顯示，高黏液表型的肺炎克雷伯菌的毒力強于非高黏液表型的肺炎克雷伯菌，hvkp的毒力強于ckp。毒力基因的比較發(fā)現(xiàn)，除毒力基因kpn外，未發(fā)現(xiàn)其余表型在hvkp和ckp間的差異，表明不能僅單一依靠一種表型定義hvkp。毒力基因kpn陽性的菌株中hvkp的毒力大于ckp，表明該基因可能成為鑒定高毒力的生物標志。另血清型K2中有3株ST25，2株毒力基因kpn陽性，蠟螟實驗表明其毒力較強，LD50與K1參考株(NTUH-K2044)的LD50(4.1±0.3)一致[18]；它們是收集自不同時間同一科室的細菌，1株來自血液，2株來自引流物，治療期間給與了美羅培南，阿米卡星，環(huán)丙沙星的聯(lián)合治療。該3例患者的臨床結局均為死亡。雖然高毒力的ST25-K2肺炎克雷伯菌目前未形成流行克隆，但基于其高危害性，在臨床監(jiān)測中應警惕[32,33]。