趙小月，張 格，汪 悅，劉紅英，陳 宇，趙 軍，王川慶，陳 陸，李永濤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒( porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙及各階段豬呼吸道癥狀為特征的傳染病[1，2]。該病最早于1987年出現(xiàn)于美國(guó)，目前在全球大部分地區(qū)流行，至今仍為困擾世界養(yǎng)豬業(yè)的一大難題。我國(guó)于1996年首次報(bào)道分離到PRRSV[3]，至今為止已歷經(jīng)20余年的流行及演變。2006年由PRRSV變異株引起的高致病性PRRS疫情在我國(guó)豬群大面積暴發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。2012年本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道來源于美國(guó)的PRRSV類NADC30毒株(HENAN-HEB和HENAN-XINX)在我國(guó)豬群的流行[5]。此后，類NADC30毒株在我國(guó)北方相繼出現(xiàn)并蔓延至全國(guó)。該類毒株之間致病性差異較大，且易與其他毒株發(fā)生重組，商品化疫苗尚不能對(duì)豬群進(jìn)行有效保護(hù)，已成為威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展最主要的PRRSV類型。此外，自2010年P(guān)RRSV類QYYZ毒株在廣東省出現(xiàn)以來，相繼蔓延至我國(guó)南方各省，此后在西北、西南、華東和華中等地區(qū)均有報(bào)道。PRRSV類QYYZ毒株與其他類型毒株之間能夠發(fā)生基因重組產(chǎn)生新的子代病毒，給養(yǎng)豬業(yè)疫病防控帶來新的挑戰(zhàn)。

目前，我國(guó)存在2種PRRSV類型，包括基因Ⅰ型和基因Ⅱ型。SHI等[12]根據(jù)8 624條PRRSV的ORF5序列將基因Ⅱ型PRRSV分為9個(gè)Lineage，每個(gè)譜系之間的遺傳距離都大于11%，并將Lineage 1細(xì)分為9個(gè)Sublineage。ZHANG等[6]首次將Lineage 3進(jìn)一步細(xì)分為5個(gè)Sublineage。我國(guó)豬群中目前流行Lineage 1，Lineage 3，Lineage 5，Lineage 8和Lineage 9等多種類型PRRSV毒株，其中 Lineage 1中的類NADC30毒株和Lineage 8中的類JXA1毒株是主要流行毒株[13]。河南地處中原、交通便利，作為我國(guó)重要的養(yǎng)豬大省和生豬調(diào)運(yùn)大省，面臨著更為嚴(yán)峻的動(dòng)物疫病輸入和傳播風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)室自2012年起持續(xù)監(jiān)測(cè)PRRSV流行情況并追蹤PRRSV流行和進(jìn)化動(dòng)態(tài)[14-15]。為了解2018―2019年河南地區(qū)PRRS流行現(xiàn)狀和演化規(guī)律，本研究通過對(duì)采自河南省18個(gè)地市的414份臨床樣品進(jìn)行PRRSV RT-PCR檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行ORF5與NSP2基因擴(kuò)增、測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，從而發(fā)現(xiàn)PRRSV最新的流行動(dòng)態(tài)和遺傳變異情況，為PRRS防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理2018年1月至2019年10月采自河南省18個(gè)地區(qū)94個(gè)豬場(chǎng)的414份豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)樣品，凍存于-80℃。

1.2 引物設(shè)計(jì)參照周峰等[15]根據(jù)GenBank中PRRSV CH-1a株(AF132118)、NADC30株(JN654459)和JXA1株(EF112445)設(shè)計(jì)針對(duì)ORF5和NSP2基因的2對(duì)特異性引物，并交河南尚亞生物科技公司合成。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA取采集病料組織樣品，用PBS按照1∶5比例進(jìn)行稀釋后，充分研磨，將組織勻漿反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心8 min，取上清。參照Trizol reagent說明書提取RNA，將提取的RNA凍存于-80℃。

將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，主要步驟為配置模板與引物預(yù)混物，70℃水浴10 min，4℃冰浴3 min 后，與反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (200 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、dNTP(10 mol/mL)混合，42℃， 1 h；70℃，15 min反應(yīng)后4℃冷卻，得到cDNA保存于-20℃用于PCR檢測(cè)。

1.4 基因序列的擴(kuò)增將陽(yáng)性樣品的ORF5基因與NSP2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠回收純化后克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液經(jīng)PCR鑒定，挑選陽(yáng)性克隆送河南尚亞生物科技公司測(cè)序。

1.5 PRRSV ORF5與NSP2基因的同源性分析與氨基酸比對(duì)將獲得的ORF5與NSP2基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行整理，通過DNAStar中的MegAlign與GenBank上公布的參考毒株序列進(jìn)行同源性分析和氨基酸的遺傳變異分析。

1.6 PRRSV的遺傳進(jìn)化分析將獲得基因序列利用MegAlign進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA 6.0對(duì)獲得的毒株序列與參考毒株序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 河南地區(qū)PRRSV的檢測(cè)結(jié)果對(duì)2018―2019年采自河南各地區(qū)的414份疑似PRRS的臨床樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，共檢測(cè)出PRRSV陽(yáng)性樣品106份，陽(yáng)性率為25.48%。按地域劃分，全省各地區(qū)豬群均存在PRRSV感染，尤其以焦作、鶴壁、安陽(yáng)和新鄉(xiāng)等豫北地區(qū)豬群陽(yáng)性檢出率較高，其中焦作陽(yáng)性率最高(表1)。此外，根據(jù)采樣時(shí)間統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，第四季度相對(duì)于其他季度陽(yáng)性率較高，檢出率為31.46%，其中2018年11月份PRRSV的檢出率最高(37.04%)，在季節(jié)交替的月份PRRSV陽(yáng)性率也明顯增高。

表1 河南各地市PRRSV陽(yáng)性檢出率

2.2 PRRSV ORF5和NSP2基因克隆、測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析通過T-A克隆、篩選陽(yáng)性質(zhì)粒以及測(cè)序共獲得83個(gè)PRRSV ORF5和31個(gè)NSP2基因序列。經(jīng)遺傳進(jìn)化分析顯示，31株P(guān)RRSV的 NSP2基因遺傳進(jìn)化分析分別和與之對(duì)應(yīng)的ORF5基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果保持一致，均處于同一譜系(圖1B，本研究毒株用紅線表示)。2018―2019年在河南地區(qū)共檢出4種類型，包括Lineage 1，Lineage 3，Lineage 5以及Lineage 8。其中74株P(guān)RRSV與NADC30處于同一進(jìn)化分支，屬于Lineage 1；6株P(guān)RRSV與QYYZ毒株處于同一進(jìn)化分支，屬于Lineage 3；2株P(guān)RRSV為類JXA1毒株，屬于Lineage 8；僅檢測(cè)到1株P(guān)RRSV 經(jīng)典毒株屬于Lineage 5(圖1A)。

2.3 Lineage 1 的遺傳進(jìn)化分析本試驗(yàn)將已獲得的74株Lineage 1 PRRSV與GenBank上69 株Lineage 1參考毒株的ORF5序列進(jìn)行遺傳演化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究檢測(cè)到的74株P(guān)RRSV均為類NADC30毒株，且類NADC30毒株屬于Sublineage 1.8(圖2，Sublineage 1.8用紅色表示)，與上述研究結(jié)果一致。

2.4 Lineage 3的遺傳進(jìn)化分析本研究將檢測(cè)到的6株類QYYZ毒株(用●標(biāo)出)同GenBank 上34株Lineage 3 PRRSV(包含本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的河南地區(qū)5株用■標(biāo)出) 的ORF5序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的6株類QYYZ毒株均為Sublineage 3.5，其中3株(HENAY-8、HENLY-11、HENLY-12)與河南地區(qū)流行毒株HENJY-1親緣關(guān)系較近，而另外3株(HENXX-22、HENXX-29、HENXX-30)則與江西流行毒株JX1411的親緣關(guān)系較近。通過遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室2014-2016年檢測(cè)到的5株P(guān)RRSV均為類QYYZ毒株，其中1株 HENNY-3屬于Sublineage 3.2，也進(jìn)一步說明河南地區(qū)早在2014之前便存在了Lineage 3的流行，且不僅是單一的Sublineage 3.5的流行。

圖1 基于部分ORF5基因(A)與NSP2基因(B)構(gòu)建PRRSV的遺傳進(jìn)化分析

圖2 74株Lineage 1 PRRSV遺傳演化分析

2.5 PRRSV ORF5基因核苷酸和氨基酸序列分析ORF5基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，74株類NADC30毒株之間ORF5核苷酸序列相似性為86.1%～100.0%,氨基酸相似性為85.5%～100.0%；與美國(guó)NADC30毒株的氨基酸相似性為90.5%～96.5%，表現(xiàn)出較大的差異性。6株類QYYZ毒株之間核苷酸相似性為88.1%～99.5%，氨基酸相似性89.6.1%～100%，同QYYZ毒株氨基酸相似性為91.0%～94.5%。另有HENSQ-3和HENXC-13毒株序列與JXA1株的同源性較高，分別為99.2%和99.0%；1株(HENZZ-16)與經(jīng)典疫苗毒株RespPRRS MLV的同源性為100.0%。

圖3 Lineage 3 PRRSV遺傳進(jìn)化分析

83株P(guān)RSSV毒株GP5蛋白均存在氨基酸替換與突變。其中，74株類NADC30 毒株的變化較大，存在有不同程度的氨基酸的缺失與插入，4株在GP5蛋白第33位缺失1個(gè)氨基酸(以VR2332為參考)，位于GP5蛋白的高變區(qū)HVR1(aa32-35)，表現(xiàn)出相同特征性的核苷酸缺失模式；6株P(guān)RRSV在GP5蛋白上第57位插入1個(gè)賴氨酸(Lsy)，該插入位點(diǎn)在GP5蛋白的高變區(qū)HVR2，部分代表毒株的氨基酸位點(diǎn)分析如圖4(方框表示插入與缺失氨基酸位點(diǎn))；在GP5蛋白的第13位和第151位毒力相關(guān)氨基酸處，有45株類NADC30毒株與NADC30保持一致(Q13和K151)，其余毒株的第13位和第151位毒力氨基酸均發(fā)生變化，其中HENXX-13與JXA1株毒力氨基酸相同(R13和R151)。

圖4 10株缺失(插入)類NADC30毒株ORF5推導(dǎo)的氨基酸比對(duì)

2.6 PRRSV NSP2基因核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列分析31株P(guān)RRSV NSP2基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列變異分析顯示，與VR2332和CH-1a株相比，出現(xiàn)多處氨基酸位點(diǎn)缺失和突變，其中29株P(guān)RRSV與NADC30毒株NSP2蛋白高度同源，與NADC30毒株存在相同缺失特征，即在322aa-432aa、483aa、504aa-522aa位缺失131個(gè)氨基酸；2株毒株(HENXX-12和HENXX-28株)在不連續(xù)的131氨基酸缺失基礎(chǔ)上，在501aa-502aa新增加2個(gè)氨基酸缺失。此外，HENSQ-3毒株與JXA1毒株 NSP2蛋白高度同源，其在481aa位及533aa-561aa共有30個(gè)氨基酸的缺失；HENZZ-16與RespPRRSV MLV 毒株NSP2蛋白基本一致，氨基酸相似性高達(dá)99%(圖5)。

圖5 31株 PRRSV NSP2推導(dǎo)的氨基酸比對(duì)

3 討論

目前，PRRS依然是嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大傳染病之一，該病能引起母豬的繁殖障礙和仔豬呼吸困難，并在國(guó)內(nèi)豬群廣泛流行[2]。本研究對(duì)河南地區(qū)414份PRRSV 疑似樣品進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，共檢出PRRSV陽(yáng)性樣品106份，陽(yáng)性率達(dá)25.48%。與本實(shí)驗(yàn)室2012―2017年對(duì)河南地區(qū)PRRSV檢測(cè)情況相比，整體上趨于穩(wěn)定，但不同地市和不同月份陽(yáng)性率差異較大。PRRSV對(duì)豬群的感染受季節(jié)變化的影響，在秋冬季節(jié)PRRSV的檢出率較高，在季節(jié)交替的月份PRRSV陽(yáng)性率也明顯增多。

PRRSV基因變異分布于整個(gè)基因組，由于GP5為PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白，其具有病毒免疫保護(hù)相關(guān)的中和抗原表位和誘騙抗原表位[16]，ORF5與NSP2是病毒基因組中變化最大的基因，因而通常將ORF5和NSP2作為病毒遺傳變異與進(jìn)化分析的靶基因。本研究測(cè)定的83株P(guān)RRSV的ORF5序列屬于4種類型，即Sublineage 1.8(NADC30-Like)，Sublineage 3.5(QYYZ-Like)，Sublineage 8.7(HP-PRRSV-Like)和Sublineage 5.1(RespPRRS MLV-like)。74株P(guān)RRSV均屬于NADC30-like(Sublineage 1.8)，占所測(cè)毒株的89.15%，說明類NADC30毒株仍是河南地區(qū)最主要的流行毒株，但是74 株類NADC30毒株之間的核苷酸和氨基酸的同源性差異較大，提示河南地區(qū)類NADC30毒株不斷進(jìn)化、更加復(fù)雜。此外，6株類QYYZ(Sublineage 3.5)毒株分別與HENJY-1和JX1411的親緣關(guān)系較近，說明河南類QYYZ毒株很有可能由外省流行毒株傳入河南并在省內(nèi)各地區(qū)傳播，加劇了省內(nèi)PRRSV流行毒株的復(fù)雜性和多樣性。通過Lineage3 遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室2014―2016年檢測(cè)到的6株P(guān)RRSV亦屬類QYYZ毒株，其中1株 HENNY-3屬于Sublineage 3.2，也進(jìn)一步說明河南地區(qū)早在2014之前便存在Lineage 3毒株，且不僅是單一的Sublineage 3.5的流行。

近幾年Lineage 3 PRRSV在華南地區(qū)廣泛流行，傳播迅速，使其在PRRSV中的比例顯著增加。研究表明中國(guó)流行的Sublineage 3.5 PRRSV是由中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的Sublineage 3.2傳至福建，由福建傳至廣東[6]。自2010年以來，中國(guó)至少有12個(gè)省份被檢測(cè)到有Lineage 3的流行，親緣關(guān)系分析顯示絕大多數(shù)省份流行的Lineage 3毒株由廣東傳入。與類NADC30毒株相似，Lineage 3在田間與PRRSV的2個(gè)不同譜系之間存在頻繁的重組。LONG等[18]報(bào)道的 PRRSV SCcd16毒株，是Lineage 3 PRRSV與Lineage 1和Lineage 8 PRRSV 同時(shí)發(fā)生的重組；此外，在福建省發(fā)現(xiàn)的1株P(guān)RRSV毒株(FJLIUY-2017)，該毒株是在Lineage 1、Lineage 3、Lineage 5和Lineage 8之間存在的復(fù)雜的基因組重組PRRSV[19]。

NSP2蛋白是PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的復(fù)制過程中起著關(guān)鍵作用，其蛋白的高變區(qū)可耐受一定數(shù)量氨基酸的突變、插入或缺失。類NADC30毒株的NSP2蛋白的131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，HP-PRRSV毒株NSP2蛋白存在30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失，類QYYZ毒株的NSP2區(qū)具有36個(gè)氨基酸的連續(xù)插入。本研究獲得的31株P(guān)RRSV NSP2基因中，29株P(guān)RRSV與NADC30毒株存在相同缺失特征，HENXX-12和HENXX-28在不連續(xù)的131氨基酸缺失基礎(chǔ)上，在501aa-502aa新增加了2個(gè)氨基酸缺失，將存在該種特殊缺失毒株的NSP2蛋白序列與GenBank中已收入的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)是一種新的缺失突變模式。此外，GP5是PRRSV變異最為明顯的結(jié)構(gòu)蛋白，包括N端信號(hào)肽區(qū)域、誘騙表位(Decoy)、中和表位(PNE)、2個(gè)高變區(qū)(HVRs)和3個(gè)跨膜區(qū)(zf7576)[22-23]?？乖稽c(diǎn)位于GP5的N端，蛋白內(nèi)的誘騙表位和數(shù)量不等的糖基化使重要的中和抗原位點(diǎn)變得不明顯，從而阻礙了中和抗體的產(chǎn)生進(jìn)而利于PRRSV的體內(nèi)增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)不同毒株GP5蛋白的氨基酸序列存在著顯著差異，類NADC30毒株HENLY-8、HENLY-9、HENLY-10和HENZMD-12株第33位氨基酸的缺失發(fā)生在N端信號(hào)肽的B細(xì)胞表位(AR27-35)和鄰近糖基化位點(diǎn)，可能對(duì)抗原表位存在空間阻位效應(yīng)。此外，HENLY-11、HENLY-12、HENAY-8、HENXX-22、JENXX-29和HENXX-30毒株GP5蛋白第57位出現(xiàn)1個(gè)新的插入位點(diǎn)(Lys57)，這種在GP5蛋白高變區(qū)出現(xiàn)的插入或缺失類型先前未有報(bào)道，該插入位點(diǎn)對(duì)病毒復(fù)制和致病性有何影響需進(jìn)一步研究。

NADC30-like毒株傳入我國(guó)時(shí)間雖然較短，但因其具有較強(qiáng)的基因變異和重組能力，迅速成為我國(guó)豬群中優(yōu)勢(shì)流行毒株。當(dāng)前的商品化疫苗對(duì)類NADC30病毒的保護(hù)效果不理想，使豬場(chǎng)PRRS臨床防控難度加大。本研究從74株NADC30-like毒株中隨機(jī)選取2株進(jìn)行全基因的擴(kuò)增與重組分析發(fā)現(xiàn)，2株P(guān)RRSV毒株均為NADC30和JXA1-P100的重組毒株，說明了類NADC30毒株與HP-PRRSV 疫苗株之間重組的普遍性，那么商品化疫苗在豬場(chǎng)的使用可能會(huì)加劇類NADC30毒株在田間毒株類型的復(fù)雜性，值得我們警惕和監(jiān)測(cè)?？偠灾怤ADC30毒株已經(jīng)成為河南地區(qū)最主要的流行毒株，HP-PRRSV毒株在逐漸減少，類QYYZ毒株的流行增加了PRRSV流行的復(fù)雜性。目前河南地區(qū)PRRSV遺傳進(jìn)化與流行都存在復(fù)雜性，主要體現(xiàn)在PRRSV毒株類型多樣性、氨基酸變異普遍性、類NADC30毒株之間的較大差異性、類NADC30毒株重組高頻性以及弱毒疫苗對(duì)強(qiáng)毒株的干擾性。合理使用商品化疫苗，做好毒株流通監(jiān)測(cè)加大對(duì)類NADC30毒株的監(jiān)測(cè)與防控尤為重要。