楊 媚,楊 泰,陳鳳鳴,馬 杰,陳清華

(湖南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128)

牛膝多糖(Achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)是從中草藥牛膝中提取的一種生物活性多糖，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和降血糖等廣泛的生物學功能，被視為可以替代抗生素的天然添加劑，已作為免疫增強劑在動物生產(chǎn)中廣泛使用[1-4]。研究表明，ABP最主要的活性是其免疫調(diào)節(jié)活性，其對機體的特異性和非特異性免疫功能均具有增強作用，主要體現(xiàn)在能夠通過促進特異性抗體生成、促進淋巴細胞增殖、提高巨噬細胞系統(tǒng)的吞噬能力、誘導細胞因子的分泌和激活補體系統(tǒng)等方式提高機體的免疫功能[5-8]。此前，對ABP免疫調(diào)控功能作用原理的研究報道多集中且局限于細胞水平[9-10]。本試驗采用ABP聯(lián)合豬瘟疫苗免疫豬只，觀察ABP對豬瘟疫苗的免疫增強作用和對血常規(guī)指標的影響，為ABP提高豬瘟疫苗的作用效果及安全應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設(shè)計選擇25日齡健康三元雜交(杜洛克×長白×大約克)去勢斷奶仔豬40頭，隨機分為4組，分別為灌胃高(ABPH)、中(ABPM)、低(ABPL)ABP劑量組和對照組(C)，每組10頭。試驗期為28 d，試驗設(shè)計與處理見表1。28日齡時，頸部肌肉注射豬瘟疫苗1.0 mL。參考課題組前期體外試驗研究結(jié)果[11]，免疫前3 d和免疫后3 d按表1給藥，每日分3次對仔豬進行灌胃。各組分別在免疫后0，7，14，21，28 d，每組隨機抽取 5頭仔豬采血，測定豬瘟抗體效價和血常規(guī)指標。

表1 試驗設(shè)計

1.2 疫苗豬瘟ST細胞系活疫苗，廣東永順生物制藥股份有限公司生產(chǎn)，使用時用滅菌生理鹽水稀釋成1頭份/mL。

1.3 豬瘟抗體效價和血常規(guī)指標測定各組仔豬分別在免疫后0,7,14,21,28 d，每組隨機抽取5頭仔豬進行前腔靜脈采血，用真空采血管采血5 mL，4℃，3 000 r/min離心15 min分離出血清，用于豬瘟抗體效價檢測。同時用EDTA抗凝采血管采血2 mL，用于血常規(guī)指標測定。豬瘟抗體檢測試劑盒蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；血常規(guī)指標檢測利用全自動血細胞儀進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel初步處理后，使用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(One-ANOVA)，以平均值±標準差表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬豬瘟抗體效價的影響由表2可知，免疫后7,14,21 d，添加ABP的試驗組抗體效價顯著高于對照組(P<0.05)，其中ABPM的抗體效價最高；免疫后28 d，ABPL與C組的抗體效價無顯著性差異(P>0.05)，ABPH與ABPM的抗體效價顯著高于ABPL和C組(P<0.05)，ABPH與ABPM間的抗體效價無顯著性差異(P>0.05)，其中ABPM的抗體效價最高。

表2 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬豬瘟抗體效價的影響(log2)

2.2 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬血常規(guī)指標的影響由表3,4可知，免疫后不同時間點，添加ABP的試驗組與C組的紅細胞數(shù)及中性粒細胞比例均差異不顯著(P>0.05)。由表5可知，免疫后7 d，ABPL組的白細胞數(shù)顯著低于C、ABPH和ABPM組(P<0.05)，且C、ABPH和ABPM組間無顯著性差異(P>0.05)，其中ABPM組的白細胞數(shù)最高；免疫后14，21 d，ABPH、ABPM組白細胞數(shù)顯著高于C組和ABPL組(P<0.05)，且ABPH、ABPM組間無顯著性差異(P>0.05)；免疫后28 d，ABPM組的白細胞數(shù)量顯著高于C、ABPH和ABPL組(P<0.05)。由表6可知，免疫后7 d，ABPH組的淋巴細胞比例顯著高于ABPL、C組(P<0.05)，ABPH組與ABPM組無顯著性差異(P>0.05)，其中ABPH組的淋巴細胞比例最高；免疫后14，21 d，ABPH、ABPL組顯著高于C組(P<0.05)，ABPH、ABPL組與ABPM組間無顯著性差異(P>0.05)，其中ABPL組的淋巴細胞比例最高；免疫后28 d，各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬紅細胞數(shù)的影響 1012/L

表4 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬中性粒細胞比例的影響 %

表5 ABP對豬瘟疫苗免疫仔豬白細胞數(shù)的影響 109/L

3 討論

植物多糖在促進巨噬細胞作用時，多表現(xiàn)為增強巨噬細胞的吞噬能力，并釋放NO及各種細胞因子來調(diào)節(jié)樹突狀細胞及巨噬細胞，激活先天性免疫及適應(yīng)性免疫，增強機體的免疫力[12-14]。一系列試驗研究發(fā)現(xiàn)，ABP增強仔豬免疫功能明顯強于促生長性能[15]。與此同時，通過研究ABP對樹突狀細胞(DC)成熟影響的結(jié)果表明，ABP能促進小鼠骨髓來源性DC的分化、成熟，提高DC表面分子的表達，促進DC的抗原遞呈能力提升[16-17]。體液免疫是由B淋巴細胞介導的一種特異性免疫反應(yīng)，機體外周血中的抗體水平是衡量體液免疫功能的重要標志[18]。豬瘟抗體水平是反映豬瘟疫苗免疫后仔豬特異性免疫功能的指標。劉永華等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給禽流感滅活苗免疫的雛雞注射0.5 mL質(zhì)量濃度為4或8 g/L的ABP均能夠顯著提高其免疫器官指數(shù)和禽流感血凝抑制抗體的滴度，進而提高禽流感滅活苗的免疫效果。邱妍等[20]用黃芪多糖、板藍根多糖、ABP和山藥多糖溶液對新城疫弱毒苗免疫的蛋公雞進行肌肉注射，結(jié)果表明,4種多糖均能顯著提高新城疫抗體效價,促進外周血T淋巴細胞增殖，并有一定的劑量和時效關(guān)系。CHEN等[21]研究證明，ABP可通過提高血清抗體和補體水平，增強細胞和體液免疫，還可通過增強體外培養(yǎng)的淋巴細胞增殖活性、促進細胞因子的產(chǎn)生，進而提高斷奶仔豬的免疫力，ABP具有劑量依賴性的免疫調(diào)節(jié)活性，而1 500 mg/kg 的劑量在斷奶仔豬體內(nèi)具有最好的效果。CD4+T細胞通過產(chǎn)生細胞因子來控制對瘧原蟲的細胞免疫應(yīng)答，CD4+T細胞產(chǎn)生的促炎性(Th1)和抗炎性(Th2)細胞因子在瘧疾感染的結(jié)果中起決定性作用，早期的促炎性細胞因子反應(yīng)介導保護性免疫[22]。多數(shù)中藥多糖通過調(diào)節(jié)巨噬細胞及樹突狀細胞的免疫活性最終起到對機體的免疫調(diào)節(jié)作用[23-24]。ZHU等[25]用ABP對瘧原蟲進行預處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABP預處理促進了樹突狀細胞的成熟，選擇性增強Th1的免疫應(yīng)答，激活小鼠抗瘧疾血液階段感染的免疫反應(yīng)，以控制瘧原蟲的增殖，并延長了感染小鼠的存活期。與上述研究結(jié)果一致，本試驗結(jié)果表示，ABP可增強仔豬的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高血清抗體水平，進而提升豬瘟疫苗的免疫效力，其中3 000 mg·頭-1·d-1對仔豬進行灌胃效果最佳。

白細胞是一個龐大的血細胞家族，在機體損傷治愈、抗御病原的入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用，當機體發(fā)生炎癥或其他疾病時都可引起白細胞總數(shù)及各種白細胞的百分比發(fā)生變化[26]。劉玉蘭等[27]發(fā)現(xiàn)LPS刺激顯著降低斷奶仔豬血液中白細胞和淋巴細胞數(shù)量，誘導仔豬產(chǎn)生急性細菌感染癥狀，而注射ABP提高了血液中白細胞數(shù)量、中性粒細胞數(shù)量及比例，表明ABP有一定的改善免疫，抵御炎癥的作用。本試驗中免疫后14,21 d，ABPH、ABPM組白細胞數(shù)顯著高于C組和ABPL組，且ABPH、ABPM組間無顯著性差異；免疫后28 d，ABPM組的白細胞數(shù)量顯著高于C、ABPH和ABPL組；說明ABP可提高血清白細胞數(shù)量，增強機體免疫力。

淋巴細胞增殖是機體免疫系統(tǒng)受到外來抗原刺激后產(chǎn)生的正常保護性生理反應(yīng)，淋巴細胞的增殖和分化是免疫應(yīng)答中的一個重要環(huán)節(jié)，淋巴細胞的數(shù)量與亞群的變化對機體免疫狀態(tài)有一定的提示作用[28]。淋巴細胞增殖率可以作為測定機體免疫功能的指標之一，其高低可反映機體的細胞免疫水平[29]。ABP對外周血淋巴細胞增殖有促進作用，可顯著促進T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖[30-31]。陳春[10]在ABP對豬外周血淋巴細胞增殖的研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的ABP均能促進豬外周血淋巴細胞的增殖，且有一定的劑量依賴關(guān)系。本試驗中，免疫后7,14,21 d，ABP對淋巴細胞的比例影響顯著。這可能是ABP促進了免疫器官的發(fā)育成熟，對淋巴細胞的生成起到了一定的促進作用。

本試驗條件下，ABP作為免疫增強劑可聯(lián)合豬瘟疫苗顯著提高抗體水平、白細胞數(shù)量和淋巴細胞比例，增強豬瘟疫苗的免疫效力，提高仔豬免疫力，其中3 000 mg·頭-1·d-1的劑量對免疫仔豬進行灌胃效果最佳。