王婧然，郭海濤，孫良振，金小虎，石學(xué)穎，林敬軼，岳順利，周佳勃

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

人工授精是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛、效果最顯著的生豬繁殖技術(shù)[1]。雖然精液冷凍技術(shù)取得了重大進展，但是精液液態(tài)保存仍然是穩(wěn)定豬精子質(zhì)量，維持其受精能力的主要方法[2]。豬生產(chǎn)企業(yè)需要優(yōu)質(zhì)高效液態(tài)保存稀釋液來提高育種和繁殖效率以提升產(chǎn)品的市場競爭力。目前，中國、美國和歐洲等豬肉生產(chǎn)大國已經(jīng)廣泛采用液態(tài)精液的人工授精[3]，液態(tài)精液人工授精在畜群健康和遺傳育種中起非常重要的作用。

雖然人們對豬精液液態(tài)保存已進行過大量研究，但是還存在著稀釋液成分復(fù)雜，保存時間不長，效果不穩(wěn)定等問題。液態(tài)保存2 d精液的分娩率一般在60%～70%，而保存到第5天時則分娩率下降50%[4]。因此，必須進一步研究豬精液液態(tài)保存過程中的精子生理情況，改進保存方法，延長保存時間，提高受胎率。

精胺是生物代謝過程中產(chǎn)生的具有生物活性的低相對分子質(zhì)量脂肪族含氮堿，是微生物、動物及人體合成核酸和蛋白質(zhì)所必需的一種調(diào)控物質(zhì)。精胺廣泛存在于哺乳動物組織和體液中，特別是在精漿中濃度較高，約為2～15 μmol/L[4]。它可參與調(diào)控動物體內(nèi)多項生命活動，如轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾、離子通道的開啟與關(guān)閉以及某些激酶的活性，還可以改變細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，增強細胞活力，誘導(dǎo)細胞自噬，延緩機體衰老[5]。睪丸組織中的精胺大部分由支持細胞和間質(zhì)細胞合成，合成量受促性腺激素的調(diào)控，參與調(diào)控睪丸的各項功能和精子發(fā)生過程[6]。精漿中的精胺相對穩(wěn)定的含量，對維持精子活力等方面具有很重要的作用[7]，但具體作用機制還有待于進一步研究。

本研究在精液保存液添加精胺，探究不同濃度精胺對豬精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性的影響。還進一步探究豬精子液態(tài)保存過程中精胺與活性氧(ROS)產(chǎn)生、線粒體膜電位、細胞凋亡以及體外受精能力的影響，期待延遲液體保存精子的保存時間，揭示精胺提高精子質(zhì)量的分子機理，為開發(fā)新型保存稀釋液，提高優(yōu)良中公畜的利用率，推動豬畜牧生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供實驗及理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑除特殊說明外，本研究所用試劑均來自Sigma-Aldrich公司。BTS(貝爾茨維爾液)作為保存液，pH7.2其包含37 g/LD-葡萄糖，6 g/L二水檸檬酸鈉，1.25 g/L乙二胺四乙酸二鈉，1.25 g/L碳酸氫鈉，0.75 g/L氯化鉀，0.05 g/L青霉素鈉，0.05 g/L硫酸鏈霉素。

1.2 精液采集與保存精液采自5頭健康可育長白種公豬，用手握法采集濃厚部精液。將采集的鮮精液溫度保持在35～37℃，45 min內(nèi)運至實驗室。鏡檢精子活力≥75%以上的精液樣品用于試驗。鮮精液需避光放置并使溫度緩慢降至室溫。將精液按稀釋比例分裝于15 mL的離心管中，300 r/min離心去除精漿，然后分別用含有不同濃度(10，100，500 μmol/L)精胺的保存液稀釋，不含精胺的處理組作為對照組，分裝至1.8 mL凍存管中，使精子的終濃度為3×107～5×107個/mL。將不同處理的凍存管置于17℃精液保存箱中保存5 d，每隔24 h取精液樣本并檢測[8]。

1.3 精子活力檢測于檢測前取適量精液樣本混勻，并放到37℃恒溫箱中預(yù)熱20 min，使用清華同方精子分析儀(MX 7.5)分析精子的各項運動參數(shù)。取10 μL預(yù)熱后的精液樣本置于計數(shù)池上，每次檢測6個視野，精子數(shù)量不少于200個。

1.4 精子質(zhì)膜完整性檢測根據(jù)文獻[9]報道的方法，精子質(zhì)膜完整性采用低滲腫脹法檢測。將20 μL 精液樣本混于100 μL預(yù)熱的低滲液(9 g/L果糖和4.9 g/L檸檬酸鈉的水溶液)中，放于37℃溫箱中孵育45 min后，取10 μL預(yù)熱后的精液樣本，在400倍的相差顯微鏡下觀察并統(tǒng)計頭部腫脹和彎尾精子數(shù)以及總精子數(shù)。每次采集6個視野，精子總數(shù)不少于200個，每組重復(fù)3次。

1.5 精子頂體完整性檢測根據(jù)周佳勃等[10]報道的方法，精子頂體完整性的檢測采用FITC-PNA染液染色法。檢測時，取100 μL精液與200 μL BTS混勻，再取10 μL混勻后的精液涂抹在干凈的載玻片上，用5 μL無水甲醇固定精液5 min。晾干后，將8 μL FITC-PNA染液滴加到樣品載玻片上并將載玻片置于37℃恒溫箱內(nèi)避光孵育30 min。孵育完后，將載玻片用 PBS 溶液沖洗3次，每次3 min，蓋上蓋玻片，然后，在 400×倒置熒光顯微鏡下觀察頂體染色情況。

1.6 精子線粒體膜電位的檢測采用MitoProbe JC-1試劑盒對線粒體膜電位進行檢測[11]。取0.5 mL精子數(shù)量為2×106個精液的樣品，加入0.5 mL JC-1染色工作液混勻。在37℃培養(yǎng)箱中染色20 min，然后在4℃下800 r/min離心5 min洗2次，棄上清，再用JC-1緩沖液(1×)重懸后，用流式細胞儀進行檢測分析，計算膜電位高的精子的比例。

1.7 精子ROS含量檢測采用DCFH-DA(2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯)染料進行精子ROS的檢測。從不同的試驗組中取0.5 mL的精液與0.5 mL BTS混勻，加入DCHF-DA，使其終濃度達到 200 μmol/L，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育 30 min，每5 min混勻1次，隨后加入 PI 檢測液(終濃度為2 μmol/L)，然后用流式細胞儀檢測分析。

1.8 精子凋亡的檢測精子凋亡采用AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測[12]。檢測時，先將1 mL精液1 500 r/min離心5 min，棄上清，再加入100 mL PBS重懸。取適量精子(1×106)與500 μL 的結(jié)合緩沖液充分混合，隨后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，在室溫下避光孵育15 min，然后通過流式細胞儀檢測凋亡率。

1.9 體外受精檢測卵母細胞體外成熟參考孫夢等[13]報道的方法進行，精子獲能和受精液均為mTBM液。精子經(jīng)過1 200 r/min室溫離心3 min，洗滌2次，然后將精子按照106個/mL在mTBM液中獲能1 h。按照每50 μL受精滴轉(zhuǎn)入30個成熟卵母細胞。再加入獲能精子使其終濃度為2.5 × 105個/mL。卵母細胞在體外受精6 h后，經(jīng)PZM-3(胚胎培養(yǎng)液)洗滌3次，并轉(zhuǎn)入PZM-3培養(yǎng)微滴中在37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后觀察并計算卵裂率，6 d后觀察并計算囊胚率。

2 結(jié)果

2.1 精胺對液態(tài)保存豬精子活力的影響見表1。結(jié)果顯示，從液態(tài)保存2 d開始，精子活力出現(xiàn)明顯變化。保存3 d，100 μmol/L精胺組與對照組相比，精子活力差異顯著(P<0.05)。而500 μmol/L精胺組的精子活力在保存2 d就顯著低于對照組(P<0.05)。保存5 d，100 μmol/L精胺組精子活力為(57.73±0.55)%仍然可達到人工授精要求。

表1 精胺對液態(tài)保存豬精子的活力的影響 %

2.2 精胺對液態(tài)保存豬精子質(zhì)膜完整性的影響如表2所示，保存1，2 d，添加10，100 μmol/L精胺組與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。從3 d開始，100 μmol/L精胺組的質(zhì)膜完整性(65.34±0.58)%顯著高于其他組的質(zhì)膜完整性(P< 0.05)。

表2 精胺對液態(tài)保存豬精子質(zhì)膜完整性的影響 %

2.3 精胺對液態(tài)保存豬精子頂體完整性的影響如表3所示，在保存液中含有10，100 μmol/L精胺組的豬精子頂體完整性均高于對照組。并且隨著保存時間的增加，差異越來越明顯。保存至5 d時，添加100 μmol/L精胺組(72.07±0.75)%精子頂體完整率與對照組(65.03±0.60)%相比，差異極顯著(P<0.01)。

表3 精胺對液態(tài)保存豬精子的頂體完整性的影響 %

2.4 精胺對液態(tài)保存豬精子線粒體膜電位的影響隨著保存時間的延長各組線粒體膜電位高的精子比例均呈逐漸下降的趨勢。由表4可知，在保存5 d，添加100 μmol/L組的膜電位高的精子比例(64.27±0.28)%顯著高于對照組(56.57±0.26)%(P<0.05)。

表4 精胺對液態(tài)保存的豬精子線粒體膜電位的影響 %

2.5 精胺對液態(tài)保存的精子ROS含量的影響由以上述得知，保存液中加入100 μmol/L精胺對豬精子液態(tài)保存效果最好。同時試驗發(fā)現(xiàn)隨著保存時間的延長，豬精子ROS含量也隨之升高。如表5所示，以保存5 d為例，加入100 μmol/L精胺組(34.83±0.52)%與對照組(41.91±0.64)%相比差異顯著(P<0.05)。

表5 精胺對液態(tài)保存的豬精子ROS含量的影響 %

2.6 精胺對液態(tài)保存豬精子凋亡水平的影響隨著保存時間的增加，對照組與試驗組的精子凋亡水平也隨之升高，但與對照組相比，添加精胺組能顯著降低精子凋亡水平。以保存5 d為例，如表6所示，加入100 μmol/L精胺組(11.92±0.35)%與對照組(19.76±0.17)%相比豬精子的凋亡水平降低，并具有顯著性差異(P<0.05)。

表6 精胺對液態(tài)保存豬精子凋亡水平的影響 %

2.7 精胺對液態(tài)保存豬精子受精能力的影響根據(jù)以上試驗結(jié)果，用保存3 d的精子進行體外受精和胚胎發(fā)育試驗。結(jié)果如表7所示，在保存液中加入100 μmol/L精胺的精子的穿透率、受精率、卵裂率和囊胚率均顯著高于對照組(P<0.05)，分別是(51.00±1.00)%，(28.00±0.58)%，(66.08±1.27)%和(23.36±0.84)%。

表7 精胺對液態(tài)保存豬精子受精和胚胎發(fā)育的影響 %

3 討論

豬精液在保存的過程中精液質(zhì)量會隨著保存時間增加而下降，具體表現(xiàn)在精子的運動能力降低、代謝活動抑制、頂體和質(zhì)膜損壞進而受精能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，添加精胺可有效抑制保存過程中豬精子的活力和質(zhì)膜完整性的下降，而且精子質(zhì)膜完整性、頂體完整率要高于對照組。這些結(jié)果表明精胺可顯著提高保存過程中豬精子的質(zhì)量，特別是具有穩(wěn)定精子細胞膜結(jié)構(gòu)的能力。AMBROSI等[14]報道了在公綿羊精子冷凍緩沖液中加精胺具有抗氧化作用，且有利于穩(wěn)定精子質(zhì)膜的性質(zhì)。據(jù)報道精胺是一種精子獲能抑制因子[5]，可以穩(wěn)定精子質(zhì)膜，抑制精子提前的異常獲能和頂體反應(yīng)，從而保證精子的正常功能不受損害。此外，研究中我們發(fā)現(xiàn)添加較高濃度的(500 μmol/L)精胺時，與對照組相比精子的活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整率都顯著下降。這與ERIF等[15]報道的精胺在犬精液冷凍保存的結(jié)果一致，添加高濃度的精胺對精子產(chǎn)生有毒作用。

線粒體功能與精子運動相關(guān)，因此線粒體膜電位可作為一種可靠的精子質(zhì)量指標(biāo)[16]。研究表明線粒體膜電位升高往往伴隨著ROS產(chǎn)生增加，ROS在細胞內(nèi)過度積累會導(dǎo)致細胞功能紊亂[17]。ROS主要源于是線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈，而維持低水平的ROS有利于促進線粒體功能。本研究中我們發(fā)現(xiàn)精胺不僅降低了ROS濃度，而且精胺的添加顯著改善了線粒體的功能，在保存5 d，添加100 μmol/L組的高線粒體膜電位的精子比例顯著高于對照組。精胺是人和大鼠精液中多胺的一種天然成分，具有重要的抗氧化能力[18]。RIGOBELLO等[19]報道精胺可以抑制大鼠肝細胞線粒體腫脹、線粒體膜電位下降和谷胱甘肽的丟失?？梢?，精胺可通過保護線粒體功能降低精子在液態(tài)保存過程中的氧化應(yīng)激從而提高保存精子的質(zhì)量。

氧化應(yīng)激不但可引起精液質(zhì)量下降、參數(shù)異常，還與精子DNA損傷成正相關(guān)。DNA碎片化是細胞凋亡最具典型的變化之一[20]。據(jù)報道精胺是一種細胞內(nèi)天然ROS清除劑，防止DNA遭到過多ROS的破壞[21]。本研究的結(jié)果進一步支持了這一觀點，精液保存過程中精子細胞凋亡比例逐漸升高，而添加精胺可以有效地降低精子細胞凋亡程度。

精子質(zhì)量與精子穿卵能力密切相關(guān)，而且精子功能缺陷是最常見的導(dǎo)致雄性不育和妊娠失敗的誘因[22]。外界不良環(huán)境，可引起精子DNA去甲基化進程受阻，降低雌配子和雄配子基因組的全能性，抑制雌雄原核形成，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育終止[23]。據(jù)文獻報道，精漿物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)精子的活力和細胞器功能，以及與母體雌性因子之間產(chǎn)生互作來改變后代表觀遺傳學(xué)，從而間接調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育[24]。豬精液在常溫保存過程中，細菌、氧化應(yīng)激和精漿中物質(zhì)的改變對精子的生理功能可產(chǎn)生不同程度的影響。本研究中我們發(fā)現(xiàn)添加100 μmol/L精胺的保存液能夠顯著提高豬精子體外受精的穿透率、總受精率、卵裂率和囊胚率。與我們的結(jié)果相一致，有研究表明精胺可以提高小鼠體外受精率，同時縮短體外受精時間[25]。豬精子質(zhì)膜上因含有大量多不飽和脂肪酸在保存過程中及易受到氧化應(yīng)激氧化損傷。氧化還原失衡會損傷精子DNA完整性，可導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育終止、胎兒流產(chǎn)和后代不育或先天缺陷。結(jié)合本研究結(jié)果添加精胺能夠維持精子氧化還原平衡，降低ROS的含量，改善線粒體功能。因此，我們推測添加精胺可能通過降低ROS對DNA損傷，改善線粒體功能狀態(tài)，提高精子在早期胚胎發(fā)育中的去甲基化進程，促進雌雄原核形成，從而間接調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育。

綜上所述，在保存液中添加精胺能顯著提高精子的活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整率。精胺可有效清除ROS，抑制精子凋亡，提高精子線粒體活性，從而延長了精子的保存時間。此外精胺還能夠增強精子穿透能力提高受精效率和后續(xù)胚胎發(fā)育能力。精胺是一種高生物活性的多胺類物質(zhì)，可在多種途徑參與細胞的功能，我們對精胺在豬精液液態(tài)保存過程中的影響仍處在基礎(chǔ)研究階段，未來可以考慮通過研究精子內(nèi)的抗氧化酶體系及細胞凋亡相關(guān)抑癌基因(p53)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)分子與精胺的互作關(guān)系進一步探究精胺改善精液品質(zhì)的具體作用機制，以期為研究精胺對雄性動物生殖細胞的影響和豬精液稀釋液的研發(fā)提供更多理論參考。