侯力丹，張亞文，蘇 奇，劉 丹，毛婭卿，王 嘉，黃小潔，趙 鵬*，李俊平*，楊漢春

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100193；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，可分為3個(gè)群，其中I群FAdV致病力和影響最大，Ⅰ群FAdV具有共同的群抗原，可分為A～E共5個(gè)種，12個(gè)血清型(FAdV1-8a，8b-FAdV11)[1]，并可引起雞的包涵體肝炎 (IBH)、心包積液綜合征(HPS) 和肌胃糜爛 (GE) 等病癥[2-3]。自2015年6月以來(lái)，我國(guó)山東、河南、河北等省份的部分地區(qū)雞群中發(fā)生了以心包積液和肝臟腫大為特征的傳染病，將該病稱為雞心包積液-肝炎綜合征[4-6]。經(jīng)過(guò)大量的研究，確定該病是由血清4型的Ⅰ群FAdV所引起[7]，近期也報(bào)道了血清4型的Ⅰ群FAdV在水禽中的感染[8]。

盡管血清4型的Ⅰ群FAdV是臨床上報(bào)道最多的流行血清型，但是仍然有其他血清型Ⅰ群FAdV也會(huì)不斷被檢出。早在1998年就曾有報(bào)道指出，通過(guò)一對(duì)通用引物可以同時(shí)檢測(cè)出Ⅰ群FAdV所有的血清型[9]。相對(duì)于引物識(shí)別的特異性，由Digoxigenin標(biāo)記的病毒核酸探針識(shí)別靶基因的特異性更高，本研究試圖開(kāi)發(fā)出可以同時(shí)檢測(cè)I群FAdV所有12種血清型的Digoxigenin標(biāo)記核酸探針。為此本研究對(duì)Ⅰ群FAdV的12種血清型參考毒株對(duì)應(yīng)的單一Digoxigenin標(biāo)記核酸探針及其混合后的多重探針用于同時(shí)檢測(cè)Ⅰ群FAdV時(shí)的靈敏度和特異性進(jìn)行了系統(tǒng)比較，建立了應(yīng)用多重Digoxigenin標(biāo)記核酸探針組合在核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)中識(shí)別Ⅰ群FAdV感染的新方法。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株及其增殖A亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup A，ALV-A)SDAU-14A1株(KU375453)、J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)NX0101株(DQ115805)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)HA9901株(AY84-2951)均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病研究室分離鑒定和完成基因組測(cè)序，上述毒株接種DF-1細(xì)胞增殖后按照Reed- Muench法測(cè)定其TCID50后凍存于-80℃?zhèn)溆?。雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)SDLY08株(FJ172347)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病研究室分離鑒定和完成基因組測(cè)序，接種SPF雞胚后按照Reed-Muench法測(cè)定其EID50后凍存于-80℃ 備用。Ⅰ群FAdV的12個(gè)血清型參考毒株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定和保存，各毒株的具體信息見(jiàn)表1，12個(gè)血清型參考毒株接種LMH細(xì)胞后按照Reed-Muench法測(cè)定其TCID50。

表1 Ⅰ群FAdV的12種血清型參考毒株GenBank登錄信息

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成參考表1所列12種血清型參考毒株的基因序列，根據(jù)其相互之間的同源性，針對(duì)不同毒株之間相對(duì)保守的hexon基因區(qū)域，用Premier 5.0設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增和合成12種不同血清型參考毒株Digoxigenin標(biāo)記探針?biāo)璧囊铩８鶕?jù)部分毒株之間的同源性，某些探針引物可用于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)參考毒株，如血清3型和血清9型參考毒株引物相同，血清4型和血清10型參考毒株引物相同，血清6型、血清7型和血清8型參考毒株引物相同，血清2型和血清11型參考毒株引物相同。不同引物的序列及其對(duì)應(yīng)的不同參考毒株核酸位點(diǎn)參見(jiàn)表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 Digoxigenin標(biāo)記核酸探針的制備與純化分別以表1所列12種血清型參考毒株的病毒DNA為模板，利用表2所列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL，其中ddH2O 36.5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，rTaq 0.51 μL，模板1 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，以O(shè)MEGA核酸凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上,選取陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序和驗(yàn)證。以測(cè)序驗(yàn)證后的12種血清型參考毒株對(duì)應(yīng)hexon基因質(zhì)粒為模板，參照羅氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)，利用表2所列引物經(jīng)PCR合成不同參考毒株的Digoxigenin標(biāo)記探針。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，以O(shè)MEGA公司核酸凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化并定量，定量后的探針凍存于-80℃?zhèn)溆?。將所有探針混合組成的組合探針標(biāo)記為探針PM。

表2 針對(duì)hexon基因用于擴(kuò)增Ⅰ群FAdV的探針?biāo)枰镄蛄?/p>

1.4 不同探針用于不同參考毒株的斑點(diǎn)雜交檢測(cè)分別將Ⅰ群FAdV的12種血清型參考毒株完整hexon基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物依次點(diǎn)樣于尼龍膜上，同時(shí)將ALV-A的SDAU14A1株、ALV-J的NX0101株、REV的HA9901株和CIAV的SDLY08株感染DF-1細(xì)胞或SPF雞胚后的總DNA點(diǎn)樣于尼龍膜上作為其他病毒對(duì)照，同樣的尼龍膜制備13張，分別與12個(gè)探針和混合探針PM按照常規(guī)方法進(jìn)行核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)。每個(gè)點(diǎn)樣處滴加同一血清型參考毒株完整的hexon基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有效核酸含量分別為500,300,100,50,10 pg等5個(gè)不同稀釋度。如表3所示，雜交膜第1行前1～5個(gè)加樣點(diǎn)分別為500,300,100,50,10 pg的參考毒株A1完整hexon基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以此類推。

表3 每張尼龍膜上滴加12個(gè)血清型參考毒株hexon基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與其他病毒順序及其核酸量 pg

2 結(jié)果

2.1 12個(gè)血清型參考毒株對(duì)應(yīng)Digoxigenin標(biāo)記核酸探針的制備分別以表1所列12種血清型參考毒株的病毒DNA為模板，利用表2所列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上,選取陽(yáng)性克隆經(jīng)上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)顯示所測(cè)序列與各毒株發(fā)表序列高度一致，證實(shí)設(shè)計(jì)合成引物具有高度的特異性。以測(cè)序驗(yàn)證后的各血清型參考毒株hexon基因質(zhì)粒為模板，以羅氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit合成了12種血清型參考毒株對(duì)應(yīng)的Digoxigenin標(biāo)記核酸探針，經(jīng)電泳鑒定(圖1)，因?yàn)楹铣傻奶结樕蠘?biāo)記Digoxigenin后相對(duì)分子質(zhì)量顯著增大，各血清型參考毒株合成后的探針相對(duì)于同樣引物擴(kuò)增的未標(biāo)記的常規(guī)PCR產(chǎn)物在電泳中呈現(xiàn)明顯滯后。用于檢測(cè)12種血清型參考毒株的Digoxigenin標(biāo)記核酸探針定量后組成了組合探針PM。

圖1 12種血清型參考毒株對(duì)應(yīng)Digoxigenin標(biāo)記核酸探針的電泳鑒定 每種血清型參考毒株對(duì)應(yīng)探針標(biāo)記前的DNA片段和標(biāo)記后的DNA片段分別以1和2標(biāo)識(shí)， -1是以參考毒株的病毒DNA為模板，利用表2所列對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增得到的電泳圖條帶； -2是以參考毒株的病毒DNA為模板，利用表2所列對(duì)應(yīng)引物以羅氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit擴(kuò)增得到的Digoxigenin標(biāo)記核酸探針電泳圖條帶;M.DL2000 DNA Marker

2.2 12個(gè)血清型Digoxigenin標(biāo)記核酸探針與各毒株雜交結(jié)果如圖2和表4所示，A1探針可以識(shí)別出50 pg的A1對(duì)應(yīng)hexon基因PCR純化產(chǎn)物，但不識(shí)別其他毒株的hexon基因PCR純化產(chǎn)物，顯示該探針相對(duì)于其自身對(duì)應(yīng)核酸具有較高的識(shí)別能力和靈敏度。而B(niǎo)5探針可以識(shí)別出B5，E6，E7，E8a，E8b等不同血清型參考毒株的對(duì)應(yīng)hexon基因PCR純化產(chǎn)物，但識(shí)別強(qiáng)度有較大差異，如B5探針可以識(shí)別出50 pg的B5和E8b 2個(gè)毒株對(duì)應(yīng)hexon基因PCR純化產(chǎn)物，識(shí)別100 pg的B6毒株對(duì)應(yīng)hexon基因PCR純化產(chǎn)物，而識(shí)別E7和E8a 2個(gè)毒株對(duì)應(yīng)Hexon基因PCR純化產(chǎn)物僅僅達(dá)到300 pg。在12種單一Digoxigenin標(biāo)記核酸探針中，沒(méi)有任何一個(gè)能夠同時(shí)識(shí)別出所有Ⅰ群FAdV的12個(gè)血清型參考毒株核酸。

2.3 應(yīng)用多重組合探針與12種血清型參考毒株的雜交結(jié)果如圖3和表5所示，應(yīng)用所有探針混合組成的多重探針PM分別與Ⅰ群FAdV的12種血清型參考毒株同時(shí)雜交時(shí)顯示出兩大優(yōu)勢(shì)，一是多重探針可以與Ⅰ群FAdV的12種血清型參考毒株均發(fā)生明顯的雜交反應(yīng)并且顯色更加明顯，顯示該方式可實(shí)現(xiàn)用于同時(shí)檢測(cè)Ⅰ群FAdV的目的；二是多重探針顯示出較高的靈敏度優(yōu)勢(shì)，多重探針可有效識(shí)別A1等7個(gè)血清型參考毒株10 pg的有效核酸，對(duì)C4等其他型參考毒株也可以識(shí)別出10～50 pg 的有效核酸，這是在單獨(dú)使用某一探針時(shí)都難以達(dá)到的靈敏度。

表4 12 個(gè)血清型對(duì)應(yīng)單一核酸探針?lè)謩e與12 個(gè)血清型毒株同時(shí)雜交的檢測(cè)靈敏度比較 pg

圖2 12個(gè)血清型對(duì)應(yīng)的單一核酸探針?lè)謩e與12種血清型毒株同時(shí)雜交的檢測(cè)結(jié)果

表5 多重探針PM與12個(gè)血清型毒株雜交的檢測(cè)靈敏度比較 pg

圖3 多重探針PM與12個(gè)血清型毒株同時(shí)雜交的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前檢測(cè)FAdV的方法有病毒分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和中和試驗(yàn)等[1，10]，這些方法具有操作繁瑣和耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。限制性核酸內(nèi)切酶技術(shù)(REA)、PCR和熒光定量PCR等分子檢測(cè)技術(shù)都可用于檢測(cè)FAdV[11-13]。近期，有報(bào)道利用更為靈敏的微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)技術(shù)檢測(cè)禽弱毒疫苗中微量的4型FAdV[14]。

目前針對(duì)FAdV的核酸檢測(cè)選擇靶基因區(qū)域主要集中于其hexon基因，Hexon是FAdV的主要表面抗原蛋白，含有型、型間特異性抗原表位及中和性抗原表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，抑制病毒構(gòu)象的改變，從而中和病毒。此外，hexon基因在FAdV各毒株中相對(duì)保守[15]，因此本研究仍舊選擇hexon基因作為檢測(cè)靶基因。

不管是常規(guī)的PCR、熒光定量PCR還是更為靈敏的微滴式數(shù)字PCR，其檢測(cè)的特異性均首先基于引物的可靠性，依賴較短的引物所建立的PCR擴(kuò)增一般需要經(jīng)過(guò)測(cè)序做進(jìn)一步的驗(yàn)證，這無(wú)疑又延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。常規(guī)的PCR可以選取擴(kuò)增長(zhǎng)度較長(zhǎng)的基因區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，引物可選擇的基因長(zhǎng)度范圍相對(duì)放寬，但熒光定量PCR和微滴式數(shù)字PCR不適宜選取擴(kuò)增長(zhǎng)度較長(zhǎng)的基因區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，而這恰恰是面對(duì)Ⅰ群FAdV的12個(gè)血清型現(xiàn)實(shí)不得不考慮的困難，在較短的區(qū)域內(nèi)選擇可以同時(shí)準(zhǔn)確而穩(wěn)定的檢測(cè)Ⅰ群FAdV的12個(gè)血清型毒株存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)于上述方法，核酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)是基于標(biāo)記探針進(jìn)行配對(duì)的技術(shù)，核酸探針的長(zhǎng)度一般要數(shù)百個(gè)bp甚至1 000 bp以上，這顯著增加了核酸探針配對(duì)的可靠性和穩(wěn)定性。為此本研究試圖探索不同血清型探針用于同時(shí)檢測(cè)Ⅰ群FAdV的可行性并首次提出使用多重核酸探針進(jìn)行雜交檢測(cè)的可行性。

盡管12個(gè)血清型的毒株均屬于Ⅰ群FAdV，并且選擇了FAdV中相對(duì)保守的hexon基因設(shè)計(jì)合成探針，但是結(jié)果和序列分析預(yù)測(cè)的一樣，沒(méi)有哪一種血清型毒株所對(duì)應(yīng)的核酸探針可以同時(shí)識(shí)別Ⅰ群FAdV的12個(gè)血清型毒株，不同的探針單一進(jìn)行雜交時(shí)識(shí)別的血清型毒株及其靈敏度均有較大的差異，如最好的以E8b毒株核酸所標(biāo)記的核酸探針可以同時(shí)識(shí)別Ⅰ群FAdV的8個(gè)血清型毒株，并且針對(duì)同血清型毒株可以識(shí)別最低濃度的核酸，但是在檢測(cè)中仍然面臨對(duì)其他4個(gè)血清型毒株漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)于單一核酸探針，應(yīng)用所有探針混合組成的多重探針PM無(wú)論是識(shí)別毒株的廣泛性還是檢測(cè)的靈敏度均體現(xiàn)出非常顯著的優(yōu)勢(shì)，這和本試驗(yàn)預(yù)測(cè)的結(jié)果是一致的。這也提示，當(dāng)某種病毒存在基因相對(duì)同源但是又存在較大的差異時(shí)，可以考慮應(yīng)用含有不同探針組合的方式來(lái)減少漏檢。

本研究建立了應(yīng)用多重Digoxigenin標(biāo)記探針在核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)中識(shí)別Ⅰ群FAdV核酸的新方法，為解決類似病毒高通量檢測(cè)提供了新的思路。