華永琳，熊 燕,*，張 靜,，郭 玉,，秦文昌，熊顯榮，字向東，殷 實，李 鍵,*

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

脂肪組織的過度沉積是導致小動物肥胖的關鍵因素，該生物學過程受到大量基因的時空表達調控。伴隨著肥胖的產(chǎn)生，機體和組織水平的炎癥細胞和炎癥因子大量產(chǎn)生，多種慢性疾病作為肥胖的并發(fā)癥出現(xiàn)，產(chǎn)生復雜的病理狀態(tài)。小鼠作為模式動物，基因改造相對容易且脂肪組織沉積特征明顯，主要有腹股溝白色脂肪組織(inguinal white adipose tissue,iWAT)、附睪白色脂肪組織(epidydimal white adipose tissue,eWAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)等，是動物脂肪沉積基因功能活體研究的理想材料。在基因功能研究中，RNA水平的調控是基因調控極其重要的一個層面。目前基于qRT-PCR的相對定量分析是檢測RNA表達水平應用最廣泛的技術，但不同的內(nèi)參基因可能導致的定量結果差異較大，偏離體內(nèi)基因表達的真實水平，因此選擇穩(wěn)定的內(nèi)參是基因相對定量分析的關鍵[1]。

脂肪組織常用內(nèi)參基因包括β2-微球蛋白(B2M)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)、β肌動蛋白(β-actin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、親環(huán)蛋白A(PPIA)、琥珀酸脫氫酶復合物亞單位A(SDHA)等基因。近年來的研究結果發(fā)現(xiàn)，在不同組織和細胞類型、細胞增殖分化不同階段、體外培養(yǎng)等情況下這些內(nèi)參基因的表達量通常變異較大[2]。YAN等[3]發(fā)現(xiàn)，RPL13a和YWHAZ組合可作為小鼠急性胰腺炎模型中的最佳內(nèi)參基因；而DESSELS等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮FBS誘導的脂肪來源的基質細胞中，RPL13a是表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。此外，在C57BL/6J和C3H/HeJ等2個品系小鼠的下丘腦、垂體和卵巢中，Gapdh和HPRT1表達最為穩(wěn)定[5]；而GU等[6]發(fā)現(xiàn)，在小鼠早期胚胎、妊娠期胎盤中Gapdh和β-actin的表達穩(wěn)定性較差。小鼠脂肪組織及細胞是研究動物體內(nèi)外脂肪沉積較好的模型，但其qRT-PCR相對定量研究的內(nèi)參基因還存在爭議。據(jù)報道，ACTB是肌內(nèi)脂肪成脂分化過程中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因[7]，但也有研究顯示ACTB不適合作內(nèi)參基因。

因此，本試驗以小鼠iWAT、eWAT和BAT為試驗材料，采用qRT-PCR方法檢測不同類型脂肪組織、白色和棕色脂肪細胞誘導分化過程中Gapdh、PPIA、18S rRNA、β-tubulin、β-actin、SDHA、UBC、ACTB和RPL13a等9個候選內(nèi)參基因的表達水平，并利用RefFinder程序(geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt)進行綜合分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期獲得小鼠脂肪沉積過程中的最優(yōu)內(nèi)參，為后期關于小鼠脂肪沉積過程中RNA定量研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物本試驗所需昆明小鼠(n=10)購于成都達碩實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于西南民族大學實驗動物中心SPF級動物房，7:00-19:00光照，19:00-07:00黑暗，自由采食，溫度控制在25℃左右。將1～2月齡雄性昆明小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精消毒處理后分別采集3種類型脂肪組織于RNA-free的EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1小鼠前體脂肪細胞培養(yǎng)及誘導分化 將采集的脂肪組織置于盛有PBS(含1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，清洗干凈后用滅菌剪刀剪碎，加入適量Ⅰ型膠原酶，于恒溫振蕩水浴鍋37℃消化30～60 min。消化完成后加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，然后離心接種于12孔板，第2天換液，以后每2 d 換1次培養(yǎng)液，至細胞密度達到70%～80%，換誘導液繼續(xù)培養(yǎng)4 d，之后換分化液繼續(xù)培養(yǎng)，并于誘導后0,2,4,6,8 d收集細胞，每個樣品收集3個重復。

1.2.2總RNA提取和cDNA合成 Trizol法提取小鼠脂肪組織及脂肪細胞的總RNA，利用核酸濃度分析儀測定RNA濃度和純度，其中將D260/D280比值為1.9～2.1的樣品按照 TaKaRa反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一條鏈，-20℃保存。

1.2.3引物設計及標準曲線構建 根據(jù)各基因在脂肪沉積中的研究進展以及前人研究[8]，本試驗選取9個內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank中的登錄序列，利用Primer Primer 5.0軟件設計引物(表1)，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。將1.2.2中小鼠脂肪組織cDNA按5倍稀釋，選取5-1～5-4稀釋倍數(shù)的樣品進行qRT-PCR，構建標準曲線。

表1 9個候選內(nèi)參基因的引物序列

1.2.4實時熒光定量PCR qRT-PCR通過BIO-RAD CFX connect real-time system運行，具體反應程序及步驟參照文獻[9]。

1.2.5內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性通過RefFinder程序進行分析。將所有候選基因qRT-PCR的循環(huán)閾值(Ct)減去最小Ct值，得到ΔCt，并轉換為相對表達量。geNorm程序通過計算2-ΔCt值測定基因表達穩(wěn)定性(M值)大小(M值越小，基因表達越穩(wěn)定)，從而判斷最穩(wěn)定及最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。當M>1.5時，該基因不適合作為內(nèi)參[10]。NormFinder與geNorm計算原理相似，根據(jù)所有候選內(nèi)參基因穩(wěn)定值的大小篩選出穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因[11]。BestKeeper則根據(jù)Ct值的幾何平均數(shù)計算出標準偏差(standard deviation，s)、變異系數(shù)(soefficient of variation，CV)、相關系數(shù)(correlation coefficient，R2)，根據(jù)s、CV值的大小判定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[12]。ΔCt法[13]根據(jù)各內(nèi)參基因的平均標準差(s)評估基因表達穩(wěn)定性。

2 結果

2.1 內(nèi)參基因引物的特異性及擴增效率對PPIA等9個內(nèi)參基因引物進行擴增，qRT-PCR熔解曲線顯示，每一個內(nèi)參基因擴增均表現(xiàn)為單個產(chǎn)物的峰值，沒有非特異性擴增(圖1)[14]，同時生成標準曲線評估引物效率。結果顯示相關系數(shù)R2為0.894 5 ～1.000 0，PCR擴增效率E為 0.75～1.16(表2),表明內(nèi)參基因的引物特異性好、擴增效率符合要求，可用于后續(xù)試驗。此外，通過分析上述組織及細胞中9個候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct)，發(fā)現(xiàn)PPIA和Ubc的Ct值在iWAT、eWAT和BAT中都比較穩(wěn)定，而18S rRNA、ACTB和Gapdh的Ct值變化較大；在白色脂肪細胞分化過程中SDHA、18S rRNA、PPIA、Gapdh的Ct值較穩(wěn)定，而在棕色脂肪細胞中Ubc、RPL13a、PPIA的Ct值較穩(wěn)定(圖2)。

2.2 小鼠脂肪沉積過程中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評估本試驗利用geNorm、Normfinder、Bestkeeper以及ΔCt等方法對其進行分析，最終推薦出適合小鼠脂肪沉積的最佳內(nèi)參基因[15]。geNorm對所有樣品的 2-ΔCt值分析顯示在小鼠3種不同類型脂肪組織中9個候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序依次為β-tubulin=RPL13a、Ubc、PPIA、β-actin、SDHA、Gapdh、ACTB、18S rRNA，其中最穩(wěn)定的是β-tubulin和RPL13a，穩(wěn)定值為0.457，其次為Ubc，最不穩(wěn)定的是18S rRNA。同時在小鼠脂肪細胞誘導分化過程中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因也是β-tubulin，而傳統(tǒng)內(nèi)參基因Gapdh、ACTB以及SDHA在小鼠脂肪沉積過程中表達不穩(wěn)定(圖3)。

圖1 小鼠脂肪組織中 9 個候選內(nèi)參基因的 Real-time PCR 熔解曲線 A.PPIA;B.β-tubulin;C.β-actin;D.18S rRNA;E.ACTB;F.SDHA;G.Gapdh;H.Ubc;I.RPL13α

表2 內(nèi)參基因標準曲線方程、相關系數(shù)(R2)及擴增效率(E)

圖2 小鼠脂肪組織及脂肪細胞誘導分化過程中9個候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值 A.1～2月齡小鼠的不同類型脂肪組織(iWAT、eWAT、BAT)中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值；B.小鼠白色脂肪細胞誘導分化過程中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值；C.小鼠棕色脂肪細胞誘導分化過程中內(nèi)參基因的循環(huán)閾值

圖3 geNorm分析小鼠不同類型脂肪組織及脂肪細胞誘導分化過程中9個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

NormFinder程序分析發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織中RPL13a基因排名第一，β-tubulin次之，18S rRNA排名最后，穩(wěn)定值達到8.888。而在脂肪細胞誘導分化過程中18S rRNA表達最穩(wěn)定，其次為β-tubulin，RPL13a基因的穩(wěn)定性介于所選9個內(nèi)參基因的中間(表3)。BestKeeper分析得出小鼠脂肪組織中9個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序為：18S rRNA>PPIA>β-actin>Ubc>RPL13α>β-tubulin>ACTB>Gapdh>SDHA(表4)。小鼠脂肪細胞分化過程中內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序為RPL13α、PPIA、Ubc、18S rRNA、SDHA、β-tubulin、β-actin、Gapdh、ACTB(表5)。此外通過比較Ct法發(fā)現(xiàn)在小鼠不同類型脂肪組織中RPL13α表達最穩(wěn)定，接下來依次為β-tubulin、Ubc、β-actin、PPIA、Gapdh、SDHA和ACTB，最不穩(wěn)定的是18S rRNA，而在脂肪細胞誘導分化過程中18S rRNA表達最為穩(wěn)定(表4，5)。

表3 利用 NormFinder 程序分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

RefFinder程序最終分析出在小鼠不同類型脂肪組織中排名前3位的內(nèi)參基因分別是RPL13α、β-tubulin、Ubc，其中RPL13α和ACTB是最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表4)。在脂肪細胞誘導分化過程中18S rRNA表達最穩(wěn)定，ACTB也是表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表5)。因此，在研究小鼠脂肪沉積過程中ACTB并不適合作為內(nèi)參基因。

表4 RefFinder程序分析小鼠脂肪組織中候選 內(nèi)參基因的穩(wěn)定值

表5 RefFinder程序分析小鼠脂肪細胞誘導分化過程中 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值

2.3 脂肪組織中內(nèi)參基因的表達驗證為驗證已篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因的可靠性，以脂肪組織最穩(wěn)定的RPL13a基因及最不穩(wěn)定的ACTB為內(nèi)參基因，用qPCR方法分析目的基因KDM2A在不同類型脂肪組織的表達。結果顯示，以RPL13α 為內(nèi)參時，KDM2A在eWAT中具有較高的表達量，BAT次之(圖4A)；而以ACTB為內(nèi)參基因時，KDM2A在BAT中表達量最高，在eWAT中表達量最低(圖4B)，進一步通過絕對定量發(fā)現(xiàn)KDM2A在不同類型脂肪組織的表達模式與以RPL13a為內(nèi)參基因的相對定量結果一致(圖4C)，表明通過上述方法分析獲得的穩(wěn)定內(nèi)參基因可靠，可廣泛作為不同類型脂肪組織基因相對定量表達的內(nèi)參基因。

圖4 小鼠不同類型脂肪組織中內(nèi)參基因的表達驗證 A.RPL13α為內(nèi)參基因時KDM2A的相對表達量；B.ACTB為內(nèi)參基因時KDM2A的相對表達量；C.絕對定量結果

3 討論

qRT-PCR是基因表達相對定量的常用方法，合適的內(nèi)參基因是獲得可靠試驗結果的關鍵[16-17]。研究表明，沒有一種內(nèi)參基因可在所有條件下被普遍使用[18]。在以往的相關研究中，由于Gapdh和ACTB在所有組織細胞中高表達且表達量恒定[19]，常被用作內(nèi)參基因。然而在人類肥胖相關研究中，CATALAN等[20]證明Gapdh是最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。GENTILE等[21]研究發(fā)現(xiàn)，RPL13α是人脂肪細胞分化過程中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這與本試驗篩選出的小鼠脂肪組織中最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因RPL13α的結果相一致。

本試驗通過多種程序分析9個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結果顯示RPL13α和18S rRNA分別是小鼠不同類型脂肪組織及脂肪細胞誘導分化過程中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。PPIA、SDHA、ACTB、Gapdh等不適合作為小鼠脂肪沉積的內(nèi)參基因，可能是由于這些基因在脂肪組織沉積或者脂肪細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PPIA是一種在肥胖中發(fā)揮重要作用的新型脂肪因子，正向調節(jié)脂肪細胞分化及機體脂肪組織的沉積[22]。有研究表明，ACTB的表達受細胞有絲分裂原的刺激[23]，前體脂肪細胞分化感受誘導信號，首先發(fā)生細胞克隆增殖，該過程中ACTB的表達上調[24]，因此ACTB也不適合作為脂肪沉積基因表達研究的內(nèi)參基因。本研究發(fā)現(xiàn)Gapdh在脂肪組織及脂肪細胞分化過程中均不適合作為內(nèi)參基因，Gapdh 是能量代謝過程中的重要激酶[25]，白色與棕色脂肪組織或細胞能量代謝過程差異較大[26]，因此不適合作為脂肪組織沉積的內(nèi)參基因。

組蛋白特異性去甲基化酶KDM2A與KDM2B同屬KDM2亞家族，KDM2B參與3T3-L1前體脂肪細胞分化早期階段，而KDM2A對小鼠脂肪沉積的作用尚未見報道[27]。因此，本試驗運用RPL13α為內(nèi)參基因來校正目標基因KDM2A在不同類型脂肪組織中的表達以及絕對定量計算每個樣品中的實際拷貝數(shù)，為后期繼續(xù)探究KDM2A基因在小鼠脂肪沉積過程中的作用奠定一定的基礎。校正結果顯示， KDM2A基因在eWAT中表達量最高，其次為BAT，而在iWAT中表達量最低，而以ACTB作內(nèi)參基因時，KDM2A基因高表達于BAT，在eWAT中表達量最低。以上結果表明，選擇合適的內(nèi)參基因對RNA定量表達的研究具有至關重要的作用。

綜上所述，本試驗成功篩選出了小鼠3種不同類型脂肪組織及白色和棕色脂肪細胞誘導分化過程中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，分別為RPL13α和18S rRNA，并以RPL13α、ACTB為內(nèi)參基因以及絕對定量來驗證KDM2A基因在腹股溝白色脂肪組織、附睪白色脂肪組織和棕色脂肪組織中的表達，為小鼠脂肪沉積過程中基因功能的相關研究提供基礎參考。